微生物篩選法檢測(cè)輻照食品的研究

趙良娟，鄭文杰，張宏偉，李宏虹，趙宏

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300201）

微生物篩選法檢測(cè)輻照食品的研究

趙良娟，鄭文杰*，張宏偉，李宏虹，趙宏

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300201）

建立一種輻照食品的微生物篩選方法。研究采用細(xì)菌內(nèi)毒素/革蘭氏陰性菌微生物篩選法檢測(cè)不同輻照劑量的雞肉、牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸、蟹棒、魷魚、蝦仁，及進(jìn)出口肉餅、糖果等食品。研究結(jié)果，表明該方法具有對(duì)多種輻照食品的初篩功能，準(zhǔn)確性好，檢測(cè)靈敏度≥1.5 kGy。細(xì)菌內(nèi)毒素/革蘭氏陰性菌微生物初篩法操作簡(jiǎn)便、快速，可以作為多種輻照食品的初篩鑒別檢測(cè)方法。

微生物篩選法；輻照食品；革蘭氏陰性菌；內(nèi)毒素

Abstract：To establish microbiological screening method for detection of irradiated food.Endotoxin/Gram negative bacteria microbiological screening method was applied to detect chicken，beef，mutton，pork，fish bolus，shrimp bolus，crab meat sleeve-fish irradiated at different absorbed dose and bakemeat and sugar.The preliminary studies demonstrated that the microbiological screening method can screen the multi-irradiated foods,and have high accuratity and the sensitivity is 1.5 kGy.Endotoxin/Gram negative bacteria microbiological screening method was simple，fast and can be used as screening method to detect the irradiated foods.

Key words:microbiological screening；irradiated foods;Gram negative bacteria(GNB);endotoxin

近年來輻照食品的潛在安全性問題存在爭(zhēng)議，盡管在目前允許的食品種類，輻照劑量的作用下的輻照食品是安全的，但不當(dāng)?shù)妮椪諘?huì)對(duì)食品的顏色、味道、營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)生一些副作用，比如脫色、有臭味、破壞一些營(yíng)養(yǎng)成分，輻照殘留也對(duì)人的健康存在安全隱患。

而且隨著進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展，輻照食品管理中標(biāo)識(shí)的問題已得到歐盟各國(guó)及日、韓等國(guó)的重視，其影響很可能類似于對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的要求一樣波及全球[1]。目前，美國(guó)、英國(guó)、德國(guó)等國(guó)家對(duì)食品輻照有比較詳細(xì)的要求，對(duì)于食品種類、輻照劑量、輻照設(shè)施、食品輻照的標(biāo)示都有明確的規(guī)定，強(qiáng)調(diào)“只有得到許可和經(jīng)批準(zhǔn)的輻照設(shè)施才能為特定的目的處理特定的食品”。因此，在日益嚴(yán)峻的食品安全問題和進(jìn)出口貿(mào)易情況下，急需建立輻照食品的鑒別檢測(cè)技術(shù)的研究。

本研究擬建立一個(gè)輻照食品的細(xì)菌內(nèi)毒素/革蘭氏陰性菌微生物快速篩選方法[2]，為輻照食品的初篩鑒別檢測(cè)研究提供試驗(yàn)依據(jù)，對(duì)保證進(jìn)出口貿(mào)易的順利發(fā)展和保障人民的健康具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料與試劑

酪蛋白消化酶、緩沖蛋白胨鹽溶液（含有酪蛋白消化酶和氯化鈉）、牛奶瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏陰性菌選擇性培養(yǎng)基（含有牛奶瓊脂和乳酸鏈球菌素）：美國(guó)BD公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋公司；結(jié)晶紫溶液：天津市佳興化工工貿(mào)有限公司；青霉素G溶液：美國(guó)Sigma公司；無內(nèi)毒素水：美國(guó)ACC或廈門鱟試劑廠；內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（10 EU/mL）、鱟試劑（靈敏度0.5 EU/mL：規(guī)格0.1 mL）：廈門鱟試劑廠；未輻照新鮮雞肉、牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸、蟹棒、魷魚、蝦仁樣品：均購(gòu)自天津菜市場(chǎng)；分別經(jīng)鈷 60 輻照 1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy等8個(gè)輻照劑量的雞肉樣品；分別經(jīng)鈷60輻照5 kGy的牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸、蟹棒、魷魚、蝦仁樣品。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

電子天平（感量為0.001 g）：瑞士Mettler Toledo公司；均質(zhì)器：德國(guó)IKA公司；恒溫培養(yǎng)箱[（21±1）℃，（37±1）℃]：德國(guó) Memmert公司；微量移液器（20 μL~200 μL，100 μL~1000 μL）：德國(guó) Eppendof公司；無內(nèi)毒素吸頭：美國(guó)ACC公司；一次性無菌注射用針筒（100mL）：江西洪達(dá)醫(yī)療器械公司；無內(nèi)毒素試管（18mm×180 mm）：美國(guó)ACC公司；一次性滅菌培養(yǎng)皿（直徑90 mm）：美國(guó)Corning公司；parafilm封口膜：美國(guó)parafilm公司。

1.2 方法

1.2.1 方法原理

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的復(fù)合物，它是細(xì)菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有內(nèi)毒素生物活性的物質(zhì)。食品經(jīng)過一定劑量輻照后，食品中活的革蘭氏陰性菌基本上會(huì)被殺死，產(chǎn)生大量的細(xì)菌內(nèi)毒素。通過對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的測(cè)定和革蘭氏陰性菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)可以估算食品中死的革蘭氏陰性菌總數(shù)與活的革蘭氏陰性菌總數(shù)。如果兩個(gè)結(jié)果的差異很大，說明該食品可能經(jīng)過輻照處理。

1.2.2 樣品制備

以無菌操作稱取剪碎后的樣品10 g，置于裝有90 mL無內(nèi)毒素水的滅菌無內(nèi)毒素塑料袋（或容器）中，充分振搖、混勻，制成10-1樣品勻液，用于革蘭氏陰性菌計(jì)數(shù)和細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)。

1.2.3 革蘭氏陰性菌計(jì)數(shù)

吸取10-1樣品勻液1 mL，加入裝有9 mL蛋白胨鹽溶液的滅菌試管中，制成10-2樣品勻液。重復(fù)相同操作，到樣品被充分稀釋（稀釋到10-5）。

傾注約10 mL制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂[保溫至（45±1）℃]于培養(yǎng)皿中，水平放置，待其凝固備用。然后分別在已凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上涂布0.1 mL不同稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度涂布兩個(gè)平板。室溫（20℃～25℃）條件下放置90 min。再傾注約10 mL革蘭氏陰性菌選擇性瓊脂[保溫至（45±1）℃]于營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面。待瓊脂凝固后將平皿翻轉(zhuǎn)，（21±1）℃培養(yǎng)（24±1）h。若平板上菌落的直徑均＜0.5 mm，該平板應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)

吸取300 μL 10-1樣品勻液，加入裝有650 μL無內(nèi)毒素水的滅菌無內(nèi)毒素試管中，制成稀釋倍數(shù)為10-0.5的樣品勻液。重復(fù)相同操作，將10-0.5的樣品勻液依次稀釋為10-1.0、10-1.5、10-2.0……直到樣品被充分稀釋（通常稀釋到10-5）。

以內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，無內(nèi)毒素水為陰性對(duì)照，分別取0.1 mL不同稀釋度的樣品勻液加入含有0.1 mL鱟試劑的無內(nèi)毒素試管中，混合搖勻，用paraflim 封口膜封閉管口，（37±1）℃反應(yīng)（60±2）min。當(dāng)試管內(nèi)的內(nèi)容物發(fā)生完全凝集時(shí)為陽(yáng)性記為“＋”，部分凝集時(shí)記為“＋/－”，未凝集時(shí)記為“－”。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)靈敏度

試驗(yàn)以雞胸肉為例，應(yīng)用革蘭氏陰性菌計(jì)數(shù)和細(xì)菌內(nèi)毒素篩選法檢測(cè)未輻照新鮮雞肉和經(jīng)鈷60輻照1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy等 8 個(gè)輻照劑量的雞胸肉樣品，革蘭氏陰性菌計(jì)數(shù)結(jié)果和細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)結(jié)果見表1和表2。

表1 不同輻照劑量的雞胸肉樣品革蘭氏陰性菌計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Gram negative bacteria number of different irradiated chicken brests

通過革蘭氏陰性菌計(jì)數(shù)和細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果可知，雞胸肉樣品分別經(jīng)0 kGy（未輻照）和1 kGy輻照后的樣品細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與革蘭氏陰性菌數(shù)都很高，log10EU/g-log10cfu GNB/g<0，該劑量輻照樣品的檢測(cè)結(jié)果是未輻照樣品。而輻照劑量為 1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy時(shí)，即當(dāng)輻照劑量≥1.5 kGy時(shí)，log10EU/glog10cfu GNB/g>0，該劑量范圍輻照樣品檢測(cè)結(jié)果均為疑是輻照樣品，需要進(jìn)一步確證。因此該方法的檢測(cè)靈敏度≥1.5 kGy。

表2 不同輻照劑量的雞胸肉樣品內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果Table 2 Endotoxin of different irradiated chicken breasts

2.2 方法的適用性

試驗(yàn)應(yīng)用革蘭氏陰性菌計(jì)數(shù)和細(xì)菌內(nèi)毒素篩選法檢測(cè)未輻照的和分別經(jīng)鈷60輻照5 kGy劑量的新鮮牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸、蟹棒、魷魚、蝦仁樣品。通過革蘭氏陰性菌計(jì)數(shù)和細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果結(jié)算得到，牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸等5種食品的0 kGy（未輻照）樣品，log10EU/g-log10cfu GNB/g<0，檢測(cè)結(jié)果為未經(jīng)輻照樣品；羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸4種食品5 kGy輻照樣品，log10EU/g-log10cfu GNB/g>0，檢測(cè)結(jié)果為疑是輻照樣品；牛肉5 kGy輻照樣品，細(xì)菌內(nèi)毒素值log10EU/g<2，且革蘭氏陰性菌數(shù)也很低log10cfu GNB/g<2，檢測(cè)結(jié)果為不可確定。

蝦仁、蟹棒和魷魚3種食品的0 kGy（未輻照）和5 kGy輻照樣品革蘭氏陰性菌數(shù)很低，幾乎為0；且log10EU/g-log10cfu GNB/g均>0，檢測(cè)結(jié)果疑是輻照食品；因此懷疑蝦仁、蟹棒和魷魚3種食品可能在購(gòu)買前經(jīng)過某種方式處理過，可能是輻照。

2.3 自然樣品檢測(cè)

試驗(yàn)中以日常檢測(cè)的出口豬肉餅20份，凝膠軟糖56份為研究對(duì)象，通過本方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下：豬肉餅18份為疑是輻照樣品；凝膠軟糖56份均為疑是輻照樣品。

因此，研究結(jié)果進(jìn)一步說明通過革蘭氏陰性菌/細(xì)菌內(nèi)毒素微生物篩選法能夠?qū)θ庵破贰⑺a(chǎn)品及日常進(jìn)出口豬肉餅、凝膠軟糖等多種輻照食品的檢測(cè)，方法具有廣泛的適用性。

3 結(jié)論

本研究利用內(nèi)毒素/革蘭氏陰性菌微生物篩選法，對(duì) 0、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy 等 8 個(gè)劑量鈷 60輻照過的無皮雞胸樣品、帶皮雞翅樣品和帶皮雞腿樣品進(jìn)行輻照檢測(cè)的初步研究。研究結(jié)果表明，該方法具有對(duì)輻照雞肉樣品初篩的功能，檢測(cè)靈敏度≥1.5 kGy。

研究中又對(duì)0 kG和5 kGy兩個(gè)輻照劑量處理的牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸、蟹棒、魷魚、蝦仁（購(gòu)自天津菜市場(chǎng)）進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果進(jìn)一步說明通過革蘭氏陰性菌/細(xì)菌內(nèi)毒素微生物篩選法能夠?qū)θ庵破贰⑺a(chǎn)品及日常進(jìn)出口豬肉餅、凝膠軟糖等多種輻照食品進(jìn)行檢測(cè)，方法具有廣泛的適用性。

因此本研究方法可以作為輻照食品的初篩鑒別檢測(cè)方法，適用于多種輻照食品的初篩檢測(cè)。

[1]董智挺.我國(guó)輻照食品現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J].福建農(nóng)業(yè)科技,2005(4):54-55

[2]EN 14569:2004 Foodstuffs-Microbiological screening for irradiated food using LAL/GNB procedures[s].

Detection of Irradiated Food by Microbiological Screening Method

ZHAO Liang-juan,ZHENG Wen-jie*,ZHANG Hong-wei,LI Hong-hong,ZHAO Hong
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin 300201,China)

2009-09-14

趙良娟（1979—），女（漢），工程師，碩士研究生，研究方

向：食品安全及微生物檢驗(yàn)。

*通信作者：鄭文杰（1969—），女（漢），研究員，博士，研究方向：食品安全及分子生物學(xué)。