小龍蝦殼中生物蛋白鈣提取工藝

廖曉峰，于榮

（東華理工大學，江西撫州344000）

小龍蝦殼中生物蛋白鈣提取工藝

廖曉峰，于榮

（東華理工大學，江西撫州344000）

采用小龍蝦蝦殼作為原料，用胰蛋白酶水解法提取生物蛋白鈣，正交試驗結果表明：酶解在pH=7.0,溫度為50℃，加酶量為1%，酶解時間為2 h的條件下進行，提取率達26.6%。利用紫外分光光度法測定蛋白質的含量，用原子吸收法測定鈣的含量，產品蛋白質含量可達27.5%，鈣的含量為5.8%，產品可作為高級飼料及補鈣制劑，同時變廢為寶，促進小龍蝦養殖與加工業的發展。

小龍蝦；蛋白鈣；紫外分光光度法；原子吸收分光光法

Abstract：The experimental use of shrimp shell as a raw material extraction,hydrolysis by trypsin extracts of biological protein calcium,the most suitable extraction conditions of pH=7.0,temperature of 50℃,plus 1%of enzyme,digestion time of 2 h conditions,extraction efficiency 26.6%.The use of UV 215 nm and 225 nm in the difference of protein content calculated.At the same time,determined by atomic absorption of calcium content,the process is simple,after extraction by up to 27.5%protein content,calcium content was 5.8%.The promotion of new types of calcium have a more far-reaching significance,while at the same time can achieve the effect of recycling.

Key words:shrimp;biological protein calcium;UV spectrophotometer;atomic absorption spectrophotometer

小龍蝦，學名“克氏螯蝦”，屬甲殼綱河蝦類，形狀似龍蝦而小，所以又稱小龍蝦。克氏螯蝦的營養成分和海蝦相當，蝦體內含的都是高蛋白、低脂肪，蛋白含量占總體的16%~20%左右，脂肪含量不到0.2%。而且所含的脂肪主要是由不飽合脂肪酸組成的，易于人體吸收。蝦肉內鋅、碘、硒等微量元素的含量要高于其它食品，同時，它的肌纖維細嫩，易于消化吸收。

龍蝦不僅是肉質潔白細嫩，味道鮮美，高蛋白，低脂肪，營養豐富。龍蝦還有藥用價值，能化痰止咳，促進手術后的傷口生肌愈合。

我國克氏螯蝦主要分布在江蘇、湖北、江西、安徽等長江中下游地區，生長在江、河、湖泊等水體中，資量在6萬t以上。

廢棄蝦殼可用來生產生物蛋白鈣。人體中的鈣元素主要以羥基磷酸鈣晶體的形式存在于骨骼和牙齒中。身體中的礦物質約占體重的5%，鈣約占體重的2%。身體的鈣大多分布在骨骼和牙齒中，約占總量的99%，其余1%分布在血液、細胞間液及軟組織中。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器、SHZ-DC（III）循環水式真空泵：鞏玉市予黃儀器有限公司；BS223S分析天平：北京賽多利斯儀器有限公司；UV751GD紫外分光光度計、WFX-120原子吸收分光光計計：北京瑞麗光學儀器廠。

1.1.2 原料及試劑

蝦頭：選取新鮮無腐敗的蝦頭作原料；氫氧化鈉：30%NaOH；胰蛋白酶：要求酶活20萬U/g以上。

1.2 制備工藝

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作步驟

1.2.2.1 預處理

蝦頭殼經分檢、去雜后,浸入50℃溫水10 min,去除部分蝦鮮味,撈取蝦頭殼,用清水反復沖洗至無浮液并瀝干待用。

1.2.2.2 烘干

將清洗好的蝦頭殼置于鼓風干燥箱中干燥，干燥溫度為70℃，時間6 h。

1.2.2.3 粉碎、均質

對達到干燥要求的蝦頭殼，先用搗碎機搗碎，后用研缽將大塊的研碎。再加入5倍的蒸餾水調勻，均質機均質1 h，收集蝦頭殼料液。

1.2.2.4 酶解

將均質后的料液放入玻璃容器里，在恒溫攪拌器上預熱至50℃，用30%的氫氧化鈉調節pH7.0~9.0左右，再按1%~2.5%投料量將胰蛋白酶投入，恒溫45℃左右，在攪拌器攪拌的條件下反應，然后加熱至80℃（5 min）,酶解完畢。

1.2.2.5 噴霧干燥

將酶解完的酶解液酶解后的料液在空氣壓力0.3 MPa，進口溫度150℃，出口溫度70℃工藝條件下進行噴霧干燥，即得成品。

1.3 蛋白質測定方法

采用215 nm和225 nm的吸收差法測定酶解液中蛋白質含量，因蛋白質的肽鍵在200 nm~250 nm有強的紫外光吸收，其光吸收強弱在一定范圍內與濃度成正比，且波長越短光吸收越強。若選取215 nm可減少干擾及光散射，用215 nm和225 nm光吸收差值與單一波長測定相比，可減少非蛋白質成分引起的誤差。因此，對酶解液中蛋白質濃度的測定可用215 nm和225 nm光吸收差法。計算采用下列經驗公式

測定范圍為 20 μg~100 μg蛋白質/mL。

2 結果討論

2.1 提取條件的單因素試驗

2.1.1 加酶量對提取過程的影響

將烘干后的蝦殼粉稱取1 g，加入5 mL水研磨，后按1%、1.5%、2%、2.5%投料量將胰蛋白酶投入，恒溫50℃，反應時間為30 min,將pH調節到7.0的條件下進行酶解。結果如表1、圖1所示。

表1 加酶量對蛋白質提取率的影響Table 1 Increase the amount of enzyme extraction rate of protein

圖1 加酶量對提取率的影響Fig.1 Increase the amount of enzyme extraction rate of protein

由圖1可看出，隨著加酶量的增加，蛋白質的提取率在不斷的下降，在加酶量為1%時蛋白質的提取率最高。

2.1.2 溫度對提取過程的影響

將烘干后的蝦殼粉稱取1 g，加入5 mL水研磨，后按2.1.1的最佳結果1%投料量將胰蛋白酶投入，恒溫45、50、55、60℃,反應時間為30 min,將pH調節到7.0的條件下進行酶解。結果如表2、圖2所示。

表2 溫度對蛋白質提取率的影響Table 2 Temperature on the extraction rate of protern

圖2 溫度對提取率的影響Fig.2 Temperature on the extraction rate of protein

由圖2可以看出當溫度為50℃時，蛋白質的提取率最大，溫度再升高，酶活性減少，隨之蛋白質的提取率下降。

2.1.3 酶解時間對提取過程的影響

將烘干后的蝦殼粉稱取1 g，加入5 mL水研磨，后按2.1.1的最佳結果1%投料量將胰蛋白酶投入，恒溫50℃(2.1.2的最佳結果),反應時間為 0.5、1.5、2、3 h,將pH調節到7.0的條件下進行酶解。結果如表3、圖3所示。

表3 反應時間對蛋白質提取率的影響Table 3 Reaction time on the extraction rate of protern

圖3 反應時間對提取率的影響Fig.3 Reaction time on the extraction rate of protein

由圖3可看出當反應時間達到2 h時酶解基本完全，這時的提取率最高。

2.1.4 pH值對提取過程的影響

將烘干后的蝦殼粉稱取1 g，加入5 mL水研磨，后按2.1.1的最佳結果1%投料量將胰蛋白酶投入，恒溫50℃(2.1.2的最佳結果),反應時間為2 h,將pH調節到7.0、8.0、9.0的條件下進行酶解。結果如表4、圖4所示。

表4 pH對蛋白質提取率的影響Teble 4 pH vaule on the extraction rate of protein

由圖4可看出pH值在9.0時蛋白質的提取率最大，隨著pH值的增大酶失去活性。

2.2 正交試驗

正交試驗見表5、表6。

從表6可看出：極差值R為因素A(0.25)、B(0.33)、C(0.26)，故影響提取蛋白質的因素的主次關系為B(反應溫度)>C(pH值)>A(反應時間)。

最佳工藝組合是：A2B2C1(即反應時間為2 h，反應溫度 50℃，pH=7.0)。

圖4 pH值對提取率的影響Fig.4 pH value on the extraction rate of protein

表5 正交試驗因素水平表Table 5 Orthogonal experimental design

表6 正交試驗Table 6 Orthogonal experiment

2.3 鈣含量的測定

生物蛋白鈣產品中除蛋白質含量外，鈣含量也是一個重要指標，為此采用原子吸收法測定產品中鈣的含量。

2.3.1 原理

樣品經濕法消化后，導入原子吸收分光光度計中，經火焰原子化后，吸收422.7 nm的共振線，其吸收量與含量成正比，與標準系列比較定量。

2.3.2 試劑

去離子水，優級純試劑；混合酸消化液：硝酸與高氯酸比為4∶1；0.5 mol/L硝酸溶液：量取45 mL硝酸，加去離子水并稀釋至1000 mL；2%氧化鑭溶液：稱取25 g氧化鑭（純度大于99.99%），加75 mL鹽酸于1000 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度；鈣標準溶液：精確稱取1.2486 g碳酸鈣（純度大于99.99%),加50 mL去離子水，加鹽酸溶解，移入1000 mL容量瓶中，加2%氧化鑭稀釋至刻度。貯存于聚乙烯瓶內，4℃保存。此溶液每毫升相當于500 μg鈣。

鈣標準使用液：鈣標準使用液的配制見表7。

表7 鈣標準使用液Table 7 Ca standard processed liquid

鈣標準使用液配制后，貯存于聚乙烯瓶內，4℃保存。

將鈣標準使用液分別配制不同濃度系列的標準稀釋液，見表8。

表8 不同濃度系列標準稀釋液Table 8 Ca standard dilution liquid

2.3.3 測定參數

測定操作參數見表9。

表9 測定操作參數Table 9 Test operating parameter

其他試驗條件：儀器狹縫(0.2 mm)、空氣及乙炔的流量、燈頭高度、元素燈電流(3 mA)等均調至最佳狀態。

將消化好的樣液、試劑空白液和各元素的標準濃度系列分別導入原子吸收分光光度計，用火焰進行測定。

2.3.4 標準曲線

以各濃度系列標準溶液與對應的吸光度繪制標準曲線。鈣標準曲線如圖5所示。

它的線性相關系數為1。濃度單位為μg/mL,則得樣品液及空白液由標準曲線查出濃度值（c及c0），再按式（1）計算。

圖5 鈣離子的標準曲線Fig.5 Standardy curve of caluiumionic

式中：X 為樣品中元素的含量，（mg/100 g）；c為測定用樣品中元素的濃度（由標準曲線查出），(μg/mL)；c0為試劑空白液中元素的濃度（由標準曲線查出），(μg/mL)；V為樣品定容體積，mL；f為稀釋倍數；m為樣品質量；1000為折算成每百克樣品中元素的含量，以mg計。

2.3.5 樣品測定

將所酶解的酶解液定容至50 mL，從中取1 mL稀釋至10 mL，用原子吸收法測定鈣離子，所得數據如表10。

表10 樣品測定結果Table 10 The determination results of sample

由表10數據可以得出鈣的含量為8.4 mg/g。人體每天所需鈣的量為800 mg/d，所以100 g的蝦殼廢料生產生物蛋白鈣就可以補充人體1 d所需的鈣量。

3 結論

小龍蝦的蝦頭、蝦殼是一種廉價的可再生資源,從蝦頭、蝦殼中提取生物蛋白鈣有較大的經濟價值。采用小龍蝦蝦殼作為原料，用胰蛋白酶水解法提取生物蛋白鈣，正交試驗結果表明：酶解在pH=7.0,溫度為50℃，加酶量為1%，酶解時間為2 h的條件下進行,提取率達26.6%。利用紫外分光光度法測定蛋白質的含量，產品蛋白質含量可達27.5%，用原子吸收法測定鈣的含量，鈣的含量為5.8%，鈣的含量也非常高，并且是生物鈣，有利人體的吸收。生產工藝不是很復雜，小投資就可使蝦頭、蝦殼變廢為寶,可作為高級飼料和補鈣制劑，創造良好的經濟效益。

[1]羅夢良，錢名權.蝦仁加工廢棄物的頭、殼的綜合利用[J].淡水漁業,2003(6):59-60

[2]楊洋.蝦頭的綜合開發利用研究進展[J].齊魯漁業,2005(1):34-35

[3]陳天忠.蝦頭、蝦殼資源綜合利用研究進展[J].湖南飼料,2006(4):35-36

[4]王信蘇,汪之和.草魚魚鱗膠原蛋白的提取[J].現代食品科技,2006,22(4):46-48

[5]隋偉,張連富.酶解蝦加工下腳料工藝的研究[J].中國調味品,2005(12):54-57

[6]大連輕工業學院.食品分析[M].中國輕工業出版社,2006

[7]吳之傳,丁純梅，陶庭先.龍蝦蝦殼的綜合利用(Ⅱ)[J].化學世界1995(9)：489

[8]蔣挺大.殼聚糖[M].北京：化學工業出版社，2000:22-24

[9]地質礦產部科學技術司.巖石和礦石分析規程[M].陜西科學技術出版社，1994:89-91

[10]李超隆.原子吸收分析理論基礎和應用[J].廣東礦冶學院學報，1980(2)：96-97

[11]Suthasinee Nilsang,Sittiwat Lertsiri,Manop Suphantharika,et al.Optimization of enzymatic hydrolysis offish soluble concentrate by commercial proteases[J].Journalof Food Engineering,2005(70):571-578

[12]Asbjorn G,Even S.A new process for advanced utilization of shrimp waste[J].Process Biochemisstry，2001，36：809-812

Extraction Process on Biological Protein Calcium of Shrimp Shell

LIAO Xiao-feng,YU Rong
（East China Institute of Technology，Fuzhou 344000,Jiangxi,China）

2009-09-11

廖曉峰（1965—），男（漢），教授，博士，從事食品研究與開發。