不同的處理方法制取姜汁對生姜蛋白酶的影響

溫東，魏旋，徐保明，*

（1.蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，河北唐山064000；2.湖北工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430068）

不同的處理方法制取姜汁對生姜蛋白酶的影響

溫東1，魏旋2，徐保明2，*

（1.蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，河北唐山064000；2.湖北工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430068）

以新鮮的老生姜為原料，采用閃式提取法、重力壓榨提取法和超聲波輔助重力壓榨提取法榨取姜汁，測定姜汁中蛋白酶的活力，確定超聲波輔助重力壓榨提取法為最優(yōu)方法。并確定超聲波輔助處理時料液質(zhì)量比為1∶3，超聲處理時間為15 min，超聲功率為250 W。

生姜；生姜蛋白酶；酶活力

Abstract：The old fresh ginger as the raw material,using flash-type extraction method,squeezing gravityassisted extraction and ultrasonic extraction method to extract ginger juice to measure the protease activity in ginger,Ultrasound-assisted gravity to determine the best method.And determine the ultrasonic-assisted processing parameter:material to liquid weight ratio is 1∶3,ultrasonic processing time is 15 min,ultrasonic power is 250 W.

Key words:ginger;ginger protease;enzyme activity

姜是重要的藥食兩用物質(zhì)，其中含有多種有用成分，如生姜多糖、姜精油、姜油樹脂、生姜蛋白酶等。生姜撞奶又稱生姜凝乳，是我國傳統(tǒng)的乳制品之一，具有悠久的歷史，起源于我國廣東省南海縣平洲和番禺縣沙灣。張平平等[1]用姜汁、生姜蛋白酶粗提物和揮發(fā)油分別進(jìn)行了凝乳試驗(yàn)，得到姜汁中起凝乳作用的物質(zhì)是生姜蛋白酶。

生姜蛋白酶是從生姜根莖中提取的一種酶，它是蛋白水解酶之一，是一種巰基蛋白水解酶類，具有蛋白酶和膠原蛋白酶雙重性質(zhì)[2]。有研究表明生姜蛋白酶的分子量大約30000 u左右，通過DEAE-纖維素層析柱對該酶進(jìn)行純化，證明該酶是由兩個組分組成，最適pH為6.5~7.0，巰基化合物為激活劑，等電點(diǎn)分別為7.0和8.0，并鑒定這兩種酶均為糖蛋白，證實(shí)糖肽型均為非O-型，純化酶的結(jié)晶為六面體[3]。提取生姜蛋白酶首先要得到姜汁，姜汁的制備方法對生姜蛋白酶的活力和提取率有很大的影響。本試驗(yàn)旨在研究不同的處理方法制取姜汁對生姜蛋白酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

生姜：購于市場；牛血清白蛋白：上海泊奧生物科技有限公司；L-酪氨酸、酪蛋白：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；NaCl：中國堯舜進(jìn)出口有限公司；考馬思亮藍(lán)G-250：上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站進(jìn)口分裝；三氯乙酸：天津巴斯夫化工有限公司；蒸餾水：自制。

Spectrumlab 755s紫外可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；FA-N/JA-N電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：城西曉陽電子儀器廠；JHBE-50A閃式提取器：北京金鼎科技發(fā)展有限公司；超聲波藥品處理機(jī)：濟(jì)寧金百特電子有限責(zé)任公司。

1.2 分析方法

1.2.1 考馬思亮藍(lán)G-250法測定生姜蛋白酶提取率[4]

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，用0.15mol/LNaCl溶解并配置不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入1 mL不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液和5 mL考馬思亮藍(lán)G-250溶液于比色管中。以加入1 mL 100 μg/mL牛血清白蛋白溶液和5 mL考馬思亮藍(lán)G-250溶液的比色管作為空白樣。用紫外分光光度計于595nm下測定各比色管內(nèi)溶液的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein concentration

取適量的不同方法制備得到的姜汁溶液和5 mL考馬思亮藍(lán)G-250溶液于比色管中，用紫外分光光度計于595 nm下測定吸光度，所得吸光度要保證在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標(biāo)曲將吸光度轉(zhuǎn)換為生姜蛋白酶的量再按式（1）計算生姜蛋白酶在生姜中的含量：

式中：Y為生姜蛋白酶的提取率，%；A為反應(yīng)物吸光度在酶含量標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的酶溶液濃度，（μg/mL）；B 為姜汁總量，mL；C 為所用生姜的重量，μg；N為姜汁稀釋倍數(shù)。

1.2.2 酪蛋白消化法測定生姜蛋白酶活力[5]

以L-酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/L HCl溶液溶解并配置不同濃度的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取10mL不同濃度的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以0.1 mol/L HCl溶液作為空白樣，用紫外分光光度計于275 nm下測定各溶液的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 酶活力測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of enzyme activity

分別精密量取不同方法制備得到的姜汁溶液適量，激活劑溶液1 mL，40℃水浴預(yù)熱10 min，加入已預(yù)熱至40℃的酪蛋白溶液5 mL，搖勻，立即置入40℃水浴中，開始計時。恒溫水浴中振蕩反應(yīng)后精密加入55%AcCl3溶液5 mL終止反應(yīng)，混勻，離心取上清液。以0.1 mol/L HCl溶液作為空白樣，用紫外分光光度計于275 nm下測定各溶液的吸光度。根據(jù)標(biāo)曲將吸光度轉(zhuǎn)換為L-酪氨酸的濃度，再按式（2）計算生姜蛋白酶活力：

式中：U為生姜蛋白酶活力；A為根據(jù)標(biāo)曲將吸光度轉(zhuǎn)換為L-酪氨酸的濃度，（μg/mL）；N為姜汁稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間，h。

按式（3）計算生姜蛋白酶比酶活力P；

式中：P 為姜蛋白酶比酶活力，（U/μg）；C為蛋白酶質(zhì)量，μg。

1.3 試驗(yàn)方法

取相同質(zhì)量的新鮮老姜3份，洗凈、切片，加入適量純水，分別采用閃式提取法、重力壓榨提取法和超聲波輔助重力壓榨提取法提取姜汁。改變超聲波助提取時的料液比(質(zhì)量比)、超聲時間和超聲功率，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，將不同方法得到的姜汁按1.2所述分析方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對姜汁中蛋白酶的影響

閃式提取法、重力壓榨提取法和超聲波輔助重力壓榨提取法對姜汁中蛋白酶的影響見表1。

表1 不同提取方法對姜汁中蛋白酶的影響Table 1 The influence of ginger protease with different extraction methods

根據(jù)表1可以看出閃式提取法的蛋白酶提取率最高，其次為超聲波輔助重力壓榨提取法，但酶活力最高的是重力壓榨提取法，其次為超聲波輔助重力壓榨提取法。這可能是因?yàn)殚W式提取法可將細(xì)胞完全打破，這樣更利于生姜蛋白酶的提取，但生姜蛋白酶是一種敏感性物質(zhì)，溫度過高、剪切力過大都可能造成蛋白酶的失活，而閃式提取設(shè)備粉碎漿的高速旋轉(zhuǎn)都會造成溫度過高、剪切力過大，從而造成蛋白酶的活力降低。超聲波輔助重力壓榨提取法中超聲波的獨(dú)特的機(jī)械振動和空化作用伴隨著強(qiáng)大的沖擊波和微聲流，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使蛋白酶更易提出而不破壞生姜蛋白酶的活力。綜上所述，選用超聲波輔助重力壓榨提取法有利于得到高活性的生姜蛋白酶，并提高了生姜蛋白酶的提取率。

2.2 不同料液比對姜汁中蛋白酶的影響

采用超聲波輔助重力壓榨提取法，用不同的料液比（質(zhì)量比）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 不同料液比（質(zhì)量比）對姜汁中蛋白酶的影響Table 2 The influence of ginger protease with different solidliquid ratio（weight ratio）

根據(jù)表2可以看出料液比（質(zhì)量比）對蛋白酶的提取率有影響，隨著加水量的增加提取率也隨之增加，對酶的活力影響不大。這可能是因?yàn)樯鞍酌傅奶崛∵^程是以擴(kuò)散傳質(zhì)為基礎(chǔ)，用適當(dāng)?shù)乃畬⑸械牡鞍酌赣晒滔噢D(zhuǎn)移至液相，得到含生姜蛋白酶的提取液，是一個固液提取過程。水量增加，料液之間的濃度差增大，有利于傳質(zhì)過程的進(jìn)行，從而提高生姜蛋白酶的提取率。但當(dāng)加水量過大時，溶液中生姜蛋白酶的濃度會過低，會造成后續(xù)濃縮工作的負(fù)擔(dān)。

2.3 不同超聲時間對姜汁中蛋白酶的影響

采用超聲波輔助重力壓榨提取法，用不同的超聲時間進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 不同超聲時間對姜汁中蛋白酶的影響Table 3 The influence of ginger protease with different ultrasonic time

根據(jù)表3可知，超聲處理時間延長有利于生姜蛋白酶的提取，但生姜蛋白酶的活力隨超聲處理時間的延長先增加后下降。這可能是因?yàn)樯鞍酌甘菬崦粜晕镔|(zhì)，延長超聲處理時間會造成局部溫度過高，從而破壞了生姜蛋白酶的活性。

3.4 不同超聲功率對姜汁中蛋白酶的影響

采用超聲波輔助重力壓榨提取法，用不同的超聲功率進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 不同超聲功率對姜汁中蛋白酶的影響Table 4 The influence of ginger protease with different ultrasonic powe

根據(jù)表4可知超聲功率增加有利于生姜蛋白酶的提取，但隨著超聲功率的增加生姜蛋白酶的活力先增加，當(dāng)功率高于250 W后，蛋白酶的活力開始下降。這可能是因?yàn)樯鞍酌笇崦舾校暪β蔬^高會造成局部溫度過高，從而使生姜蛋白酶失活。

4 結(jié)論

1）溫度和剪切力都會對生姜蛋白酶的活力產(chǎn)生影響，選用超聲波輔助重力壓榨提取法有利于得到高活性的生姜蛋白酶，并提高了生姜蛋白酶的提取率。提取率為0.933%，活力為190 U。

2）采用超聲波輔助重力壓榨提取法，料液比為1∶3時，有利于蛋白酶的提取，且不會對后續(xù)的濃縮工作造成負(fù)擔(dān)。提取率為0.935%，活力為190 U。

3）采用超聲波輔助重力壓榨提取法，超聲處理時間為15 min時，有利于生姜蛋白酶的提取，且不會破壞蛋白酶的活性。提取率為0.897%，活力為190 U。

4）采用超聲波輔助重力壓榨提取法，超聲功率為250 W時，有利于生姜蛋白酶的提取，且不會因局部溫度過高而影響蛋白酶的活力。提取率為0.911%，活力為192 U。

[1]張平平,黃雪松,劉憲華.姜汁凝乳的研究[J].中國乳品工業(yè),1999,27(5):17-19

[2]曾劍超.姜汁凝乳機(jī)理的探討[D].西華大學(xué),20084:8-9

[3]代景泉.生姜蛋白酶的分離純化及其部分特性的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2002(5):5-7

[4]韓雅珊.食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1992:57-62

[5]周惠,魯治斌,齊杰,等.蛋白水解酶活力測定新方法[J].生物化學(xué)雜志,1994,10(5):630-632

The Influence of Ginger Protease with Different Ways Extract Liquid from Ginger

WEN Dong1,WEI Xuan2,XU Bao-ming2,*
（1.Mengniu Dairy(Group)Co.,Ltd.,Tangshan 064000，Hebei,China；2.School of Chemical and Environmental Engineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068，Hubei,China）

2010-02-01

溫東（1979—），男（漢），碩士，研究方向：食品加工工藝。

*通信作者：徐保明（1966—），男，高級工程師，副教授。