固定化β-甘露聚糖酶制備甘露低聚糖的研究

楊偉東

（寶雞文理學院，陜西寶雞721007）

固定化β-甘露聚糖酶制備甘露低聚糖的研究

楊偉東

（寶雞文理學院，陜西寶雞721007）

研究用固定化β-甘露聚糖酶水解魔芋精粉制備甘露低聚糖的工藝。試驗結果表明反應時間、魔芋精粉濃度、溫度及加酶量對甘露低聚糖的制備有一定影響，其中魔芋精粉濃度和加酶量影響較大，反應溫度影響較小。通過正交試驗優化出的固定化β-甘露聚糖酶制備甘露低聚糖的最佳工藝條件為：魔芋精粉濃度2%；加酶量為6400 U；反應溫度70℃；反應時間17 h。在此條件下甘露低聚糖的得率為30.8%。

甘露低聚糖；固定化β-甘露聚糖酶；魔芋精粉

Abstract:The process conditions of Mannan-Oligosaccharides is studied by this paper,that produced by Immobilized β-mannanase.Experimental results show that the reaction time,konjac flour concentration,temperature and the amount of Immobilized β-mannanase on the Mannan-oligosaccharides have some influence,it is most influence that konjac flour concentration and time of reaction,but temperature was less.The orthogonal test results show when time was 17 h,temperature was 70℃,concentration of konjac flour was 2%,and amount of Immobilized β-mannanase was 6400 U.The synthesis of galacto-oligosaccharide amount was 30.8%.

Key words：mannan-Oligosaccharides;immobilized β-mannanase;konjac flour

甘露低聚糖是近年來國際上頗為流行的一種新型功能性低聚糖，它是由2個～10個甘露糖通過糖苷鍵連接形成主鏈，再在主鏈上連接葡萄糖或半乳糖的雜聚寡糖。它能有效促進人體內有益細菌雙歧桿菌的生長繁殖，調節腸道菌群平衡，增強人體免疫力等多種功能[1]。由于游離酶的價格很高,為了節約成本,用固定化酶來生產甘露低聚糖具有許多游離酶無法比擬的優點[2-4]。例如反應后酶可以重復回收使用,可以實現連續生產,并且易于制成各種各樣的生物反應器,因此得到廣泛的利用。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

黑曲霉β-甘露聚糖酶：陜西科技大學生命科學與工程學院食品分析實驗室制備；魔芋精粉：武漢清江魔芋制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 固定化β-甘露聚糖酶的制備

用0.5%的乙酸溶液配制1.5%的殼聚糖溶膠,并將其涂抹在60目～100目的層析硅膠上。再用戊二醛對硅膠—殼聚糖顆粒進行化學修飾,交聯3h后徹底水洗至洗脫液中沒有戊二醛,然后加入β-甘露聚糖酶于冰浴中攪拌1 h后,放入冰箱中4℃吸附過夜。次日用蒸餾水徹底水洗,過濾干燥,即得到固定化β-甘露聚糖酶[5-8]。

1.2.2 DNS試劑的配制

酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入3，5-二硝基水楊酸0.03 g，NaOH 2.1 g，苯酚0.5 g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL，貯于棕色瓶中，室溫保存。

1.2.3 固定化酶活力測定

固定化酶活力的測定方法：將10 mL用pH=5.8的緩沖溶液配制的0.3%的魔芋精粉底物于75℃的水浴中預熱10 min,然后加入0.3 g的固定化酶準確反應10 min后,從中吸取1 mL反應液，然后加入3 mL DNS試劑于沸水浴中加熱5 min后比色。

1.2.4 甘露低聚糖的制備

配制一定pH值的磷酸緩沖溶液，置于150 mL帶塞錐形瓶中，加入一定量的魔芋精粉，預熱后加入一定量的固定化β-甘露聚糖酶，在一定溫度的恒溫搖床中反應一段時間，取樣，用薄層色譜法檢測各糖組分的含量。

1.2.5 甘露低聚糖的檢測

采用上行的薄層色譜法，以硅膠G作薄板，正丙醇∶水（體積比）=85∶15 為展開劑，點樣量為 0.2 μg/μL，用苯胺-二苯胺-磷酸溶液噴霧后于110℃加熱下顯色10 min，用直接測定法檢測各糖組分含量。

1.2.6 單因素試驗

按照甘露低聚糖的制備方法，以甘露低聚糖得率為考察指標，依次進行了7個乳清粉濃度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%；8個反應溫度：55、60、65、70、75、80、85、90 ℃；8 個 pH 值：3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；7 個酶用量：1280、2560、3840、5120、6400、7680，8960 U；17 個反應時間(h)的單因素試驗。每個水平重復3次，測定結果取平均值。

1.2.7 正交試驗

根據單因素試驗結果，以甘露低聚糖得率為考察指標，選擇反應溫度、魔芋精粉濃度、酶添加量和反應時間，設計4因素3水平正交試驗L9（34），進行3次平行試驗，結果取其平均值，通過極差分析和試驗結果優化固定化酶法制備甘露低聚糖的最佳工藝條件。

2 結果與討論

2.1 反應時間對甘露低聚糖得率的影響

在反應溫度60℃、乳清粉濃度3%、pH5.8、固定化酶用量6400 U時，研究了不同的反應時間對甘露低聚糖得率的影響，結果見圖1。由圖1可知：當反應時間小于15 h時，隨著反應時間的增加，葡甘露低聚糖得率逐漸增加；當反應時間大于15 h時，隨著反應時間的增加，葡甘露低聚糖得率反而逐漸減小。這是因為當反應時間小于15 h時，β-甘露聚糖酶隨機降解糖苷鍵，葡聚糖分子被分解成各種糖類，隨著時間的增加甘露低聚糖得率逐漸增加。當反應時間大于15 h時，隨著時間的增加，甘露低聚糖分子被分解成單糖。

2.2 反應溫度對甘露低聚糖的影響

在反應時間為15 h，乳清粉濃度3%、pH5.8、固定化酶用量6400 U時，研究了不同反應溫度下固定化酶法制備甘露低聚糖的反應歷程，結果如圖2所示。

圖1 反應時間對甘露低聚糖得率的影響Fig.1 The effect of reactive time on yield of Mannan-Oligosaccharides

圖2 反應溫度對甘露低聚糖得率的影響Fig.2 The effect of the amount of enzyme activity on Mannanoligosaccharides

如圖2可知，當溫度小于70℃時，隨著溫度的升高，甘露低聚糖的得率逐漸增加，說明溫度升高有利于糖苷鍵的斷裂；當溫度大于70℃時，隨著溫度的升高，甘露低聚糖的得率反而逐漸降低，這是由于甘露聚糖酶部分失活。

2.3 加酶量對甘露低聚糖得率的影響

加酶量對甘露低聚糖得率的影響見圖3。

圖3 加酶量對甘露低聚糖得率的影響Fig.3 The effect of the concentration of Konjac on Mannanoligosaccharides

由圖3可知，當加酶量小于6400 U時，隨著加酶量的增加，甘露低聚糖得率逐漸增加；當加酶量大于6400 U時，甘露低聚糖得率隨著加酶量的增加反而減小，這是因為過多的酶將甘露低聚糖分解成為單糖。

2.4 底物濃度對葡甘露低聚糖得率的影響

底物濃度對葡甘露低聚糖得率的影響見圖4。

圖4 魔芋精粉濃度對甘露低聚糖得率的影響Fig.4 The effect of the temperature of the reactive on Mannanoligosaccharides

由圖4可知，當魔芋精粉濃度小于2%時，隨著魔芋精粉濃度的增大，甘露低聚糖的得率逐漸增加；當魔芋精粉濃度大于2%時，甘露低聚糖的得率隨著魔芋精粉濃度的增大反而減小，這是因為當魔芋精粉濃度較高時，甘露聚糖酶只將甘露聚糖分解成聚糖，而不是形成低聚糖。

2.5 正交試驗的結果

正交試驗的結果見表1。

表1 正交結果及分析Table 1 The result of orthogonal

對正交試驗結果進行極差分析可知，各因素極差值大小順序為 RD＞RC＞RA＞RB，4 個因素對甘露低聚糖制備影響的主次順序為D＞C＞A＞B。分析得知，各因素的最優水平組合是A3B1C2D2，即魔芋精粉濃度2%、固定化酶量6400 U、溫度70℃、反應時間17 h。在各因素的最優水平組合條件下固定化酶法制備甘露低聚糖，重復3次進行驗證試驗，測得甘露低聚糖得率平均為30.8%。

3 小結

通過單因素試驗和均勻試驗得出最佳工藝條件：魔芋精粉膠濃度為2%；加酶量為6400 U；反應溫度70℃；反應時間17 h。在該工藝條件下甘露低聚糖得率為：30.8%。

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The Study of Production of Mannan-Oligosaccharides by Immobilized β-mannanase

YANG Wei-dong
（Baoji University of Sciences and Arts,Baoji 721007,Shaanxi,China）

2010-04-02

楊偉東（1979—），男（漢），助教，碩士研究生，研究方向：生物新材料的制備與檢測。