響應面優化大麥中熱穩定蛋白質的提取條件

陳霞，石維忱，翟明昌，姚峻，莫新迎，韓丹，趙長新，*

（1.大連工業大學生物與食品工程學院，遼寧大連116034；2.中國發酵工業協會，北京100833）

響應面優化大麥中熱穩定蛋白質的提取條件

陳霞1，石維忱2，翟明昌1，姚峻1，莫新迎1，韓丹1，趙長新1，*

（1.大連工業大學生物與食品工程學院，遼寧大連116034；2.中國發酵工業協會，北京100833）

利用響應面分析法考察緩沖液提取大麥熱穩定蛋白的浸提時間、液料比和浸提溫度對大麥中熱穩定蛋白含量的影響。通過試驗數據分析得到，其最佳浸提溫度為20.126℃，液料比為6.437∶1（mL/g），浸提時間為119.326 min，此時通過緩沖液提取得到的熱穩定蛋白含量為2.189 mg/g。

熱穩定蛋白；大麥；響應面分析

Abstract:Heat-stable proteins of barley play a major role in the formation,stability,and texture of head foams.With response surface methodology,we investigated that temperature，extract time and extract water had an effect on the contents of heat-stable proteins in the barley.The results showed that the optimum conditions of heat-stable proteins are ：extract temperature 20.126 ℃,ratio of material to water 6.437∶1（g/mL），extract time 119.326 min，the highest extracting purity is 2.189 mg/g.

Key words：barley;heat-stable proteins;response surface analysis

大麥是啤酒生產的重要原料，其蛋白質組成和含量是決定啤酒品質的重要因素。大麥中的熱穩定蛋白能夠經過發芽、糖化以及煮沸發酵等過程后仍然得以保存[1-2]，成為決定啤酒口感、風味、泡沫及膠體穩定性等品質指標[3]。蛋白質Z和LTP1（磷脂轉移蛋白）是大麥熱穩定蛋白中的主要組分，蛋白質Z主要的胚乳清蛋白（占清蛋白總量的5%左右），能夠增強泡沫的穩定性并可能與啤酒泡沫冷渾濁的生成有關[4]，LTP1是糊粉層中的小分子球蛋白，分子量約10 ku，可能是種子的淀粉酶和蛋白酶的抑制劑（probable amylase/protease inhibitor,PAPI）。在釀造過程中，熱穩定蛋白分子的大小和構象上發生的變化增強了其泡沫活性[5]，因此對大麥及啤酒中熱穩定蛋白的研究越來越多并受到廣泛的關注[6]。由于大麥中熱穩定蛋白含量相對不高，因此本文以大麥為原料，利用響應面分析法對大麥中熱穩定蛋白的提取條件的顯著因子進行探索，確定了最佳的提取條件，減少了提取熱穩定蛋白的損失，為啤酒生產及熱穩定蛋白的研究提供可靠的理論基礎和試驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大麥：Gairdner（澳大利亞產），由中糧麥芽（大連）有限公司惠贈。

試劑為 DTT：Merk、EDTA·Na2：Sigma、考馬斯亮藍 G250/R250、牛血清蛋白、Tris、HCl、NaCl試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Unic-7200分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；AL104電子分析天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Hitachi-G21高速離心機：上海尤尼柯儀器有限公司；HH恒溫水浴鍋：鞏義市英山谷予生化儀器廠；可調萬用電爐：山東省龍口市先科儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質的提取

熱穩定蛋白的提取流程：大麥→粉碎→稱量→提取緩沖液浸提→高速離心→上清液→大麥熱穩定蛋白提取液。

大麥用干磨機磨碎3 min，準確稱取1 g（扣除水分后的絕干重量），加入一定體積的20℃提取緩沖液（Tris-Cl 50 mmol/L，NaCl 10 mmol/L，DTT 1 mmol/L，EDTA·Na21 mmol/L，pH7.5），搖勻，置一定溫度下提取相應時間，其間每10 min搖振1次。2800×g離心10 min，棄去沉淀，上清液即為大麥熱穩定蛋白粗提取液。將此粗提液在置于100℃沸水浴中20 min，之后4000×g離心15min，所得上清液為熱穩定蛋白提取液[7]。

1.3.2 蛋白質含量測定

Bradford法，使用的牛血清白蛋白作為標準蛋白[8]，濃度單位：mg/mL。

1.3.3 試驗單因素條件選取

浸提溫度為 4、8、12、16、20、24 ℃，液料比為 3、4、5、6、7、8 mL/g，浸提時間為 30、60、90、120、150、180 min進行試驗，每組蛋白提取液通過1.3.2蛋白質含量測定，觀察對大麥中熱穩定蛋白提取量的影響。

1.3.4 提取條件的進一步優化方法

在單因素試驗的基礎上，為進一步確定最佳熱穩定蛋白的提取條件，本試驗以單因素試驗的3個因素為試驗因子，以蛋白含量為響應值進行響應面設計，并對試驗數據進行分析，從而確定提取熱穩定蛋白質得率的最佳條件。

2 結果與討論

2.1 液料比對熱穩定蛋白含量的影響

在浸提時間為120 min，浸提溫度為20℃條件不變的情況下，考察蛋白含量隨浸提溫度的變化關系，結果如圖1。

由圖1可知：在液料比小于6 mL/g時，熱穩定蛋白的提取量隨液料比的增大顯著升高，當液料比為6 mL/g時，大麥熱穩定蛋白含量達最高值，大麥熱穩定蛋白浸提充分，所以繼續升高液料比，其浸提含量基本不變。所以，單因素試驗最佳選液料比為6 mL/g，并以此對其它提取條件進行單因素試驗。

2.2 浸提時間對熱穩定蛋白含量的影響

在浸提溫度為20℃，液料比為6 mL/g條件不變的情況下，考察蛋白含量隨浸提溫度的變化關系，結果如圖2。

圖1 液料比對熱穩定蛋白含量的影響Fig.1 Effects of the heat-stable proteins versus different extract water to material rate

圖2 浸提時間對熱穩定蛋白含量的影響Fig.2 Effects of the heat-stable proteins versus different extract time

由圖2可見,在浸提時間小于120 min時,熱穩定蛋白的提取量提高比較顯著,在120 min～180 min內，熱穩定蛋白含量變化不大。可能由于提取液破壞了細胞膜，使蛋白質等物質流出細胞并溶于提取液中，隨著浸提時間的變化，熱穩定蛋白溶于提取液中的含量也不斷升高，當蛋白充分溶解時，浸提時間不再對其溶解量有影響，熱穩定蛋白含量基本不變。因此根據圖2，單因素試驗最佳浸提時間為120 min，以此對浸提溫度進行確定。

2.3 浸提溫度對熱穩定蛋白含量的影響

在浸提時間為120 min，提取液體積為5 mL條件不變的情況下，考察蛋白含量隨浸提溫度的變化關系，如圖3。

由圖3可見，隨著浸提溫度的不斷變化，大麥熱穩定蛋白的提取量變化較大，溫較低于12℃，蛋白含量增幅不大；當浸提溫度為20℃時，熱穩定蛋白含量最高為1.686 mg，是16℃的1.14倍。因此單因素試驗最佳浸提溫度條件為20℃。

圖3 浸提溫度對熱穩定蛋白含量的影響Fig.3 Effects of the heat-stable proteins versus different extract temperature

2.4 響應面法對大麥熱穩定蛋白提取條件的優化

在單因素試驗基礎上，確定Box-Behnken設計的自變量,以熱穩定蛋白提取量為響應值，運用Minitab15數據處理軟件進行響應曲面分析 (response surface analysis,RSA)，對提取條件進行優化。響應面設計因素水平設計見表1，響應面分析試驗結果見表2。

表1 響應面設計因素與水平Table 1 Level of factors chosen for the trials

表2 響應面分析試驗結果Table 2 Result s of RSM analysis

對試驗數據進行多項式擬合回歸,以提取熱穩定蛋白的量為因變量，浸提溫度(X1)、提取液體積(X2)和浸提時間(X3)為自變量建立回歸方程如下：

對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗,結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression eqution

熱穩定蛋白的提取量與試驗3個因素的回歸方程的F=145.81,P＜0.01,方程顯著。回歸方程的線性相關系數為0.9894，說明因變量與3個自變量之間的線性關系顯著。

回歸方程的方差分析見表4。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

從方差4分析表中可以看出，方程一次項、二次項的影響都是顯著的，交互項作用影響不顯著，故交互項可以省略，也可以看出各具體試驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系[9]。

圖4～圖6直觀地反映了各因素交互作用對響應值的影響。比較3圖可知，浸提溫度和液料比對大麥熱穩定蛋白的提取率影響比浸提時間的影響更為顯著。

圖4 浸提溫度和液料比對熱穩定蛋白提取量的影響Fig.4 Effects of the heat-stable proteins versus different extract temperature and water to material rate

2.5 驗證性試驗

對回歸方程求一階偏導數等于零，可得到3個方程，y=2.18933-0.57979X21-0.20547X22-0.05604X32+0.121X1+0.08737X2-0.03238X3-0.03250X1X2-0.009X1X3-0.00975X2X3

圖5 浸提時間和液料比對熱穩定蛋白提取量的影響Fig.5 Effects of the heat-stable proteins versus different extract time and water to material rate

圖6 浸提溫度和浸提時間對熱穩定蛋白提取量的影響Fig.6 Effects of the heat-stable proteins versus different extract time and temperature

聯立方程組（1）、（2）、（3） 解得 X1＝0.12649、X2＝0.4372、X3=-0.67418提取熱穩定蛋白的最佳條件為：浸提溫度為20.126℃、液料比為6.437 mL/g、浸提時間為119.326 min，由回歸方程確定熱穩定蛋白的最大提取量為2.193 mg。采用響應面分析法求得的最佳條件進行3組平行試驗,結果得出實際提取量為2.186 mg，平均誤差為0.319%，與理論預測值基本相符。因此，利用響應面分析法得到的提取條件是可靠的，具有一定的實用價值。

3 結論

本試驗通過單因素試驗和響應面分析法，對大麥熱穩定蛋白的提取條件進行了優化，分析確定大麥熱穩定蛋白的最佳提取條件：浸提溫度為20.126℃、提取液體積為6.437 mL、浸提時間為119.326 min。

大麥是啤酒的主要原料，其中大麥中的熱穩定蛋白被公認為是啤酒泡沫的重要組成成分[10]，具有相當高的研究價值。本研究是對熱穩定蛋白研究的補充，具有較高應用價值，為大麥中的熱穩定蛋白的進一步研究提供可靠的試驗依據。

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Optimization of Extraction Technology Condition of Heat-stable Proteins from Barley Using Response Surface Methodology

CHEN Xia1，SHI Wei-chen2，ZHAI Ming-chang1，YAO Jun1，MO Xin-ying1，HAN Dan1，ZHAO Chang-xin1,*
（1.School of Bio＆ Food Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning,China；2.Fermentation Industry Association of China，Beijing 100833,China）

2010-04-21

國家“十一五”國家科技支撐計劃重點項目(2007BAK36 B01)

陳霞(1983—)，女（滿），在讀碩士研究生，研究方向：釀造大麥中熱穩定蛋白的研究。

*通信作者：趙長新(1955—)，男，碩士研究生導師，研究方向：發酵機理和大麥蛋白組學。