木糖發酵生產2,3-丁二醇條件的優化

韓寧寧，肖冬光，張翠英，胡亞麗，林康

（工業微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

木糖發酵生產2,3-丁二醇條件的優化

韓寧寧，肖冬光*，張翠英，胡亞麗，林康

（工業微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

利用一株肺炎克雷伯氏菌發酵木糖生產2,3-丁二醇，運用單因素試驗和四因素三水平L9（34）正交試驗設計的方法，探討發酵pH、溫度、裝液量和轉速對2,3-丁二醇產量的影響。結果表明：在木糖濃度80 g/L、接種量6%（體積分數）、初始pH值6.0、轉速120 r/min、裝液量80 mL/250 mL、35℃的條件下發酵84 h，木糖利用率為90%，2,3-丁二醇的質量濃度為33.0 g/L，得率為0.46 g/g，達到理論值的92%。

肺炎克雷伯氏菌；2,3-丁二醇；木糖；發酵

Abstract:The production of 2,3-butanediol was carried out from fermentation of xylose by Klebsiella pneumoniae.The effects of pH，temperature,amount of medium and rotation on 2,3-butanediol were studied by the single-factor tests and L9（34）orthogonal design experiment.The parameters of optimum fermentation were suggested as follows：xylose mass concentration 80 g/L,inoculum 6%（volume fraction），initial pH value 6.0，rotation120 r/min，amount of medium 80 mL/250 mL and 35℃，concentration of 2,3-butanediol reached 33.0 g/L and yield of 2,3-butanediol from xylose was 0.46 g/g.

Key words：Klebsiella pneumoniae；2,3-butanediol；xylose；fermentation

2，3-丁二醇（2，3-Butanediol，2，3-BD）是一種重要的化工原料和液體燃料，廣泛應用于化工、醫藥、食品及航空航天等領域[1-4]。工業上生產2，3-丁二醇的主要方法是化學法，其生產2，3－丁二醇主要是以石油裂解時產生的四碳類碳氫化合物在高溫高壓下水解得到，然而隨著石油危機的日趨加劇，尋找新的可替代能源成為迫切需要解決的問題[5-6]。微生物可以利用糧食或木質纖維素為底物生產2，3－丁二醇，其中利用葡萄糖為底物生產2，3－丁二醇研究較多。但由于糧食危機的存在，利用豐富而且廉價的可再生資源木質纖維類物質為原料發酵生產2，3－丁二醇成為必然趨勢。木糖是木質纖維原料水解產物中含量僅次于葡萄糖的一種單糖,由半纖維素水解生成,含量可達植物纖維水解糖類的35%以上[7]。目前文獻報道中多研究利用由木質纖維素降解的葡萄糖，木質纖維素的利用率僅為30%左右[8]，以木糖為底物發酵生產2,3-丁二醇的研究將會提高木質纖維類原料的利用率，可使木質纖維素的利用率達50%以上，在開發新能源和環境保護等方面具有重要的經濟效益和社會效益[9-10]。本文研究了各種發酵條件對肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae 10011發酵木糖生產2,3-丁二醇的影響。

1 材料和方法

1.1 菌種

肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae，CICC，10011）：中國工業微生物菌種保藏中心。

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基（g/L）

葡萄糖20；蛋白胨10；酵母粉5；氯化鈉10；瓊脂20。

1.2.2 種子培養基（g/L）

木糖20；蛋白胨10；酵母粉 5；氯化鈉10；pH 7.0。

1.2.3 發酵培養基（g/L）

木糖 80；酵母粉 15.0；KH2PO410.0；K2HPO410.0；（NH4）2SO42.0；檸檬酸鈉 4.0；MgSO4·7H2O 0.4；CaCl20.05；FeSO4·7H2O 0.005；ZnSO4·7H2O 0.005；EDTA 0.05；pH 6.0。

1.2.4 試劑

2,3-丁二醇（Sigma，色譜純），異戊醇（天津市光復精細化工研究所，色譜純），D-木糖（博大泰克，分析純），試驗過程中使用的其他化學試劑均為分析純以上級別。

1.2.5 主要儀器

7890A型氣相色譜儀：美國安捷倫科技公司；722型分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 發酵培養條件

種子培養：取一環斜面種子接入裝有一定量液體培養基的250 mL三角中，置于37℃恒溫培養箱靜止培養24 h。按6%的接種量轉接一級種子到250 mL三角瓶中，置于37℃恒溫培養箱靜止培養18 h。

初始發酵培養條件：按5%的接種量轉二級種子培養基到發酵培養基中，250 mL三角瓶裝液量為100 mL，初始pH為6.0，置于37℃搖床上發酵，搖床轉速為100 r/min。其中初始pH值、溫度、裝液量、接種量、轉速、木糖濃度各單因素在優化過程中會進行相應的變化。

1.4 分析方法

1.4.1 木糖濃度的測定

采用地衣酚法[11]。發酵液于4000 r/min轉速下離心15 min，取上清液適當稀釋，使稀釋液中木糖濃度控制在 0 μg/mL~33 μg/mL 范圍內。

1.4.2 2,3-丁二醇濃度的測定

用乙酸乙酯與發酵液離心上清液以體積比1∶1進行萃取，待靜置分層后取上層液進行氣相分析。

氣相色譜具體測定條件如下：色譜柱：Aglient HPINNOWax 1909IN-213；柱長：30 m；內徑：0.320 mm；檢測器：FID（250℃）；柱溫：180℃；進樣溫度：230℃；載氣壓力：氮氣（1.8 mL/min）；氫氣（30 mL/min）；空氣（300 mL/min）；內標物：異戊醇。

2 結果與討論

2.1 pH值對2,3-丁二醇產量的影響

pH在調節細菌的代謝過程中起著重要的作用，尤其是在含有大量復合產物的發酵過程中，pH對發酵結果的影響尤為明顯。本試驗將發酵液初始pH值調至不同水平，考察了初始pH值對丁二醇產量的影響，試驗結果見表1。

表1 初始pH值對2,3-丁二醇產量的影響Table 1 Effects of initial pH to 2,3-butanediol

從表1可以看出，當pH值為6.0時木糖的利用率及2,3-丁二醇的得率均達到最大值，當pH值低于或高于6.0時木糖利用率及2,3-丁二醇質量濃度均有明顯下降，可見pH值對該發酵過程影響較為顯著，其適宜的pH值為6.0。

2.2 溫度對2,3-丁二醇產量的影響

通常細菌發酵的最適溫度范圍是30℃～37℃[12]，本試驗檢測了這個范圍內的溫度變化對發酵木糖產2,3-丁二醇的影響，試驗結果見表2。

表2 溫度對2,3-丁二醇產量的影響Table 2 Effects of temperature to 2,3-butanediol

表2結果顯示，在30℃~37℃之間，木糖利用率和2,3-丁二醇的得率均隨著溫度呈先升高后降低的趨勢，在35℃時木糖利用率及2,3-丁二醇的得率達到最高。

2.3 裝液量對2,3-丁二醇產量的影響

通氣量對于2,3-丁二醇發酵具有重要的影響，搖床轉速固定在100 r/min，調節不同裝液量進行發酵，考察裝液量對丁二醇產量的影響，試驗結果見表3。

由表3可知：裝液量太大，溶氧效果差，2,3-丁二醇的產量低；裝液量太小，溶氧過大，也降低了2,3-丁二醇的產量，結果表明l00 mL/250 mL裝液量最好。

2.4 接種量對2,3-丁二醇產量的影響

接種量通常也是影響發酵的一個重要因素，本試驗考察了不同接種量對發酵木糖產2,3-丁二醇的影響，試驗結果見表4。

表3 裝液量對2,3-丁二醇產量的影響Table 3 Effects of amount of medium to 2,3-butanediol

表4 接種量對2,3-丁二醇產量的影響Table 4 Effects of inoculum to 2,3-butanediol

由表4可知，接種量為6%時發酵木糖產生的2,3-丁二醇量最高。接種量小時，木糖利用率低，產生的2,3-丁二醇的量也低；接種量過大時，發酵液中2,3-丁二醇的量降低，可能的原因是接種量過大時，底物中糖含量不足以滿足菌種生長需要，營養物過早耗竭，導致菌體過早自溶影響2,3-丁二醇產量。

2.5 轉速對2,3-丁二醇產量的影響

2,3-丁二醇是典型的微好氧代謝產物，2,3-丁二醇的形成與溶氧有密切的關系，隨著溶解氧的升高，2,3-丁二醇的形成量增高，但是溶氧量過高，反而使產量下降[13]。本試驗考察了不同轉速對2,3-丁二醇產量的影響，試驗結果見表5。

表5 轉速對2,3-丁二醇產量的影響Table 5 Effects of rotation to 2,3-butanediol

由表5可知：不同的搖床轉速對2,3-丁二醇的產量有很大的影響。當搖床轉速控制在125 r/min，2,3-丁二醇的產量最大。

2.6 初始木糖濃度對2,3-丁二醇產量的影響

木糖質量濃度也會對發酵有較大影響，試驗結果見表6。

表6 初始木糖濃度對2,3-丁二醇產量的影響Table 6 Effects of xylose concentration to 2,3-butanediol

從表6中本試驗結果可以看出，初始木糖濃度較低時，木糖利用率較高；而當初始木糖質量濃度繼續升高時，木糖利用率明顯下降，可能是菌體生長受到一定的抑制作用[14]。隨著初始木糖質量濃度的升高，2,3-丁二醇的得率先增加后減少，在80 g/L時達到最大，為0.45 g/g，確定為最佳木糖發酵濃度。

2.7 L9（34）正交試驗

由單因素優化試驗可知，pH值、溫度、裝液量、轉速對木糖發酵產2,3-丁二醇影響較大，因而選取這4個因素進行L9（34）正交試驗。每一試驗條件重復3次，共27組試驗，2,3-丁二醇產量取3組試驗產量的平均值，試驗設計及結果分析見表7、表8和表9。

表7 正交試驗因素水平表Table 7 The levels of factors table of orthogonal experiment

表8 正交試驗的極差分析Table 8 The analysis of range of orthogonal experiment

從表7的直觀分析和表8的F值可知，4因素對木糖發酵產2,3-丁二醇影響的顯著性次序為：轉速＞pH值＞溫度＞裝液量。4因素的最佳配比為A2B2C1D2，即pH為6.0、溫度為35℃、裝液量為80 mL/250 mL、轉速為120 r/min。根據方差分析，pH值、溫度和轉速都是影響較為顯著的因素。

表9 正交試驗方差分析Table 9 The analysis of variance of orthogonal experiment

注：**代表極顯著。

表10 驗證試驗結果Table 10 Results of identification experiment

表10為在最佳配比A2B2C1D2的條件下對木糖產2,3-丁二醇的發酵條件進行重復性驗證試驗，2,3-丁二醇平均濃度可達33.0 g/L，試驗結果高于預試驗和正交設計優化9個試驗號，從而證明了優選發酵條件的合理性。驗證試驗結果都在95%置信區間內，說明正交試驗有較高的準確性。

3 結論

1）利用木糖為底物生產2,3-丁二醇，通過對發酵條件的優化，使2,3-丁二醇產量達到33.0 g/L，為木質纖維素的利用和開發奠定了良好的基礎。

2）木糖單因素試驗結果顯示，木糖發酵產2,3-丁二醇存在底物抑制現象，可以通過流加底物補料發酵解決這個問題，從而2,3-丁二醇產量有望進一步得到提高，同時提高了木質纖維素的利用率。

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Optimization of Fermentation Conditions for 2,3-Butanediol from Xylose

HAN Ning-ning,XIAO Dong-guang*，ZHANG Cui-ying，HU Ya-li,LIN Kang
（Key Laboratory of Industrial Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

2010-04-28

天津科技大學自然科學基金，項目編號：20090401

韓寧寧(1983—)，女（漢），碩士研究生，研究方向：現代釀造技術。

*通信作者