高效液相色譜法測定食品中非食用色素

王榮艷，賈麗，范筱京

（北京市理化分析測試中心，北京100089）

高效液相色譜法測定食品中非食用色素

王榮艷，賈麗，范筱京

（北京市理化分析測試中心，北京100089）

建立食品中的酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O染料殘留的高效液相色譜同時測定的方法，樣品通過提取之后，采用基質固相分散法凈化，然后分別用乙醇和乙醇-氨水-水（7∶2∶1）分步洗脫，最后進行HPLC分離、檢測。此方法的回收率平均為79%，酸性橙Ⅱ的檢出限為0.01 mg/kg、堿性橙2的檢出限為0.02 mg/kg，堿性嫩黃O染料的檢出限為0.01 mg/kg，相對標準偏差平均為3.53%。

酸性橙Ⅱ；堿性橙2；堿性嫩黃O；基質固相分散；高效液相色譜法

Abstract：This paper described a newly developed High Performance Liquid Chromatography （HPLC）method for simultaneous determination of acid orangeⅡ、basic orange 2 and basic flavine O in foods.Samples were extracted,cleaner up through Matrix solid phase dispersion（MSPD）.The three forbidden food pigments were eluted by ethanol and ethanol-ammonia-water（7∶2∶1）respectively,and separation and detection by HPLC.The recoveries of methanol were 79%,the detection limit of acid orangeⅡ，basic orange 2 and basic flavine O was 0.01 mg/kg，0.02 mg/kg and 0.01 mg/kg separately.The relative standard deviation of this method was 3.53%.

Key words：acid orangeⅡ；basic orange 2；basic flavine O；Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD)；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O均為工業染料，用于染絲、麻、皮革等，這3種物質均可以使人致癌，根據GB2760-2007《食品添加劑使用衛生標準》規定，這3種物質嚴禁作為食品使用。但不法商販利用其顏色鮮艷、著色穩定、價廉的特點非法添加于豆制品中，使腐竹、豆皮的色澤光亮，欺騙消費者，嚴重危害了廣大消費者的身體健康[1]。目前，酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O的檢測方法有高效液相色譜法[2-4]，以及DB33/T 703-2008《食品和農產品中多種堿性工業染料的測定液相色譜-串聯質譜法》中采用液相色譜—質譜聯用檢測堿性橙和堿性嫩黃O，尚未檢索到同時檢測酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O的相關文獻，初步建立了用高效液相色譜法同時測定以上3種物質的方法，該方法能快速、準確、簡便的檢出酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O，可以滿足食品檢驗的需要。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HPLC系統配2998二極管陣列檢測器（Waters 2695）；高速冷凍離心機（SIGMA 4K15）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠RE52CS）；固相萃取裝置（Agela）。

甲醇、無水乙醇（色譜純）；無水硫酸鈉（分析純）；冰乙酸（分析純）；甲酸（分析純）；氨水（分析純）；高純水；酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O標準品（優級純）。

標準溶液配制：準確稱取10.0 mg堿性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O標準品，用甲醇溶解并準確定容到10 mL容量瓶，制成標準貯備液。準確移取標準溶液適量，用甲醇稀釋制成系列標準混合溶液。

1.2 樣品處理方法

1.2.1 提取

稱取10.0 g粉碎均勻的豆制品，置于50 mL離心管中，加入3 g無水硫酸鈉和15 mL無水乙醇，搖勻，超聲提取30 min，然后以5000 r/min離心5 min，將上清液倒入雞心瓶中。殘渣再用無水乙醇提取2次，重復上述步驟，合并上清液于雞心瓶中。將雞心瓶置于旋轉蒸發儀上50℃濃縮至近干。

1.2.2 凈化

用20 mL高純水溶解雞心瓶中物質，加入1.5 g聚酰胺粉，混勻，60℃水浴放置30 min。將混合物置于底層墊有濾紙的10 mL注射器中制成萃取柱，如圖1所示。

使其液滴均勻滴下（必要時，可以在固相萃取裝置上操作），用10 mL無水乙醇洗脫，收集洗脫液Ⅰ于雞心瓶中；然后分別用10 mL高純水和10 mL甲醇/甲酸混合液（體積比6∶4）洗滌萃取柱，棄去洗滌液，再用無水乙醇/氨水/水混合液（體積比 7∶2∶1）洗脫，收集洗脫液Ⅱ于燒杯中。

1.2.3 濃縮定容

將盛有洗脫液Ⅰ的雞心瓶置于旋轉蒸發儀上50℃濃縮至近干，用甲醇溶解，并準確定容至2 mL；將盛有洗脫液Ⅱ的燒杯置于沸水浴中蒸至近干，用水溶解，并準確定容至2 mL。最后定容液過膜待測。

1.3 色譜分離條件

色譜柱：Agilent SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫：25℃；PDA檢測器（波長范圍：350 nm～550 nm）；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min。流動相：甲醇：20 mmol/L乙酸銨溶液體積為65∶35。

2 結果與討論

2.1 色譜條件選擇

由于酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O 3種物質的pH值有所不同，所以同時檢測3種物質時流動相選擇不能具有酸堿性，通過試驗發現采用20 mmol/L的乙酸銨和甲醇作為流動相，以及Agilent SB-C18，在等度條件下即可將3種物質很好的分開且峰形良好；用二極管陣列檢測器掃描350 nm～550 nm，發現在450 nm時酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O都有較好的峰形，如圖2。

2.2 前處理條件的選擇

由于乙醇具有較強的極性，酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O都能很好的溶于乙醇，且其對環境的污染小，故選擇乙醇作為提取液；由于聚酰胺粉具有較強的吸附性，所以采用其作為基質固相分散劑，這樣染料會被聚酰胺粉吸附，減少食品中蛋白質、淀粉和脂肪等物質的干擾；由于酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O的酸堿性不一樣，所以在用聚酰胺吸附之后用2種洗脫劑分步洗脫，最后用HPLC檢測，結果較好，如圖3所示。

2.3 標準曲線和檢出限

配制0.1 g/mL～20 g/mL的標準溶液，進樣測定，以峰面積（y）對質量濃度（x，g/mL）作圖，得到酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O的線性方程。酸性橙Ⅱ的線性方程為y=26576x+653.19，R2=0.9997，堿性橙2的線性方程為y=42361x+538.92，R2=0.9997，堿性嫩黃O的線性方程為y=51301x-2851，R2=0.9997。以信噪比S/N為3時對應的目標物濃度確定檢出限，得到本方法對豆制品中酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O的檢出限分別為 0.01、0.02、0.01 mg/kg。

2.4 回收率和精密度試驗

取樣品進行標準添加試驗，每個添加量做6個平行試驗，試驗結果見表1。

表1 樣品加標回收率試驗結果（n=6）Table 1 The recovery tests for samples（n=6）

3 結論

首次采用高效液相方法同時檢測非食用色素酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O，方法靈敏度高，用聚酰胺粉作為基質固相分散劑凈化樣品，無須使用價格昂貴的固相萃取小柱，對結果干擾小，在實際工作中具有很強的應用價值。

[1]陳文,王正猛,吳曉蓉,等.單掃描極譜法連續測定食品中非食用色素酸性金黃和酸性大紅[J].食品科學,2005,26(6)：210-212

[2]林欽.高效液相色譜法同時測定豆制品中的堿性橙和堿性嫩黃O染料[J].色譜，2007,25(5)：776-777

[3]劉寧,肖白曼,張劍峰.HPLC法測定食品中非食用色素酸性橙Ⅱ[J].中國民康醫學，2006,18(2)：104-105

[4]李亞森,潘英,陳艷.用HPLC法測定食品中酸性橙Ⅱ和酸性金黃的探討[J].職業與健康，2008,24(2)：123-124

High Performance Liquid Chromatography Method for the Determination of Inedible Pigment

WANG Rong-yan，JIA Li，FAN Xiao-jing
（Beijing Center for Physical and Chemical analysis，Beijing 100089，China）

2010-04-15

王榮艷（1982—），女（漢），碩士研究生，主要從事農產品質量安全方向研究。