食品中產志賀毒素大腸桿菌的多重PCR檢測

李睿，戴詩皎，楊敬鏡，瞿敏，劉志國

（武漢工業學院生物與制藥工程學院，湖北武漢 430023）

食品中產志賀毒素大腸桿菌的多重PCR檢測

李睿，戴詩皎，楊敬鏡，瞿敏，劉志國

（武漢工業學院生物與制藥工程學院，湖北武漢 430023）

針對產志賀毒素大腸桿菌的stx2、wzy、hlyA的保守序列，設計特異性的引物，建立一種新的多重PCR檢驗方法。結果顯示，該方法特異性強，擴增結果與各參考菌株基因型一致，并能良好的區分出O157菌株和非O157型產志賀毒素大腸桿菌。該方法能用于食品樣品的檢測和流行病學分離株的快速鑒定。

產志賀毒素大腸桿菌；多重PCR；hlyA；stx2；wzy

Abstract:Specific primers were designed according to the conserved loci of stx2,wzy and hlyA genes of Shiga toxin-producing Escherichia coli（STEC）.A Multiplex PCR method was then developed.The result demonstrated that this method was highly specific.It detected the presence of the three target genes in a manner consistent with the known genotype of each reference strain.O157 and non-O157 STEC strains could also be well distinguished.The multiplex PCR developed in this study could be used for mass screening of food samples,and identification of clinical STEC isolates.

Key words：Shiga toxin-producing Escherichia coli;multiplex PCR;hlyA;stx2;wzy

產志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC；或稱 Vero toxin-producing Escherichia coli,VTEC）是食品主要病原菌之一[1]。STEC 包括 O157：H7、O157：H- 、O6、O26、O111、O91 等血清型[2]。世界上許多國家相繼發生了STEC的感染流行，對食品安全造成嚴重危害[3]。STEC主要毒力因子是stx1、stx2基因，分別編碼志賀毒素1和志賀毒素2。兩種毒素毒力不同，志賀毒素2比志賀毒素1毒力更強,更易引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥等食物中毒并發癥[4]。大質粒上編碼溶血素的hlyA基因亦是STEC重要毒力因子[5]。目前STEC的檢測是一個難點。以O157特異的標志基因-O抗原聚合酶基因wzy和stx2、hlyA基因開發多重PCR檢測技術，為檢測食品中的STEC菌株提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

大腸桿菌 O157：H7 EC1、EC2、EC3：均為日本九州大學生命科學與技術學院食品衛生實驗室贈送；大腸桿菌O157：H7 EC4號菌株、單核增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙門氏菌：武漢市疾病預防控制中心提供；大腸桿菌O157：H7 EC5號菌株、普通大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌由武漢工業學院食品安全實驗室保存。

1.1.2 試劑

CT-SMAC培養基：青島海博生物技術有限公司；新生霉素：上海創賽科學儀器有限公司；GoldView核酸染料：上海賽百盛基因技術有限公司；AxyPrep細菌基因組試劑盒、Taqmix預混合PCR試劑盒武漢華順生物技術有限公司；DNA marker、引物合成：武漢鼎國生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制備

將O157菌株接種到LB液體培養基中，37℃過夜培養，然后用AxyPrep細菌基因組試劑盒提取DNA。

1.2.2 多重PCR檢測體系

PCR 體系為：8 μL dd H2O,12.5 μL 2×Taqmix 混合液，10 μM wzy 上下游引物各 1 μL,10 μM stx2 上下游引物各 0.5 μL,10 μM hly 上下游引物各 0.25 μL,1 μL DNA。PCR擴增程序：94℃變性1 min,55℃45 s，72℃60 s，共35個循環；72℃延伸10 min。

1.2.3 多重PCR特異性實驗

用本實驗室保存的各種菌株提取DNA，做多重PCR檢測，確定引物的特異性。

1.2.4 多重PCR靈敏度實驗

用大腸桿菌EC1號菌株DNA為模板，梯度系列稀釋后，做多重PCR檢測，確定靈敏度。

1.2.5 人工染菌樣品實驗

將EC1號菌株LB液體培養基過夜培養16 h～20 h，然后10倍梯度稀釋。取100 μL梯度稀釋菌液營養瓊脂平板培養，進行菌落計數。同時取無大腸桿菌O157感染的新鮮牛肉25 g,將牛肉均質，加入10－1梯度稀釋菌液，振蕩混合0.5 h。取1 mL混合液，離心后用AxyPrep細菌基因組DNA試劑合提取DNA。然后梯度稀釋，進行多重PCR，確認檢出限。

2 結果與分析

2.1 多重PCR引物設計

在 NCBI GenBank數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下載wzy和stx2基因序列，在保守區內設計引物。hlyA基因引物參照文獻[6]。引物對見表1。

表1 多重PCR引物序列信息Table 1 Sequences of primers in the multiplex PCR

2.2 多重PCR特異性實驗

前期研究結果表明，大腸桿菌O157：H7 EC1、EC2、EC3、EC4、EC5 號菌株均攜帶兩種志賀毒素和hlyA基因，多重PCR檢測結果與之一致，3組引物擴增均能得到預期PCR產物，見圖1。單核增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙門氏菌、普通大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等則呈陰性結果（圖片未附），表明多重PCR特異性強。

2.3 多重PCR靈敏度實驗

用純菌DNA做多重PCR靈敏度驗證試驗，DNA濃度為1.88 ng/μL時，3組基因都能良好擴增出。DNA濃度持續降低，stx2、wzy引物對靈敏性下降，但hlyA基

2.4 人工染菌樣品試驗

當稀釋度為10－5時，stx2、wzy基因有模糊的產物條帶。稀釋度為10－9時，仍可檢測hlyA基因,對應平板菌落計數為平板菌落計數為1.2 cfu/mL。將3組基因均能獲得良好擴增的對應稀釋度作為檢測的最高靈敏度，則多重PCR檢測的最高稀釋度為10－5。每個稀釋度相應進行平板計數，稀釋度為10－5時，平板菌落計數為 1.2×104cfu/mL。

3 結論

STEC的檢測是一個難點，傳統檢測方法一般是通過平板分離出單菌落后，采用免疫試劑盒測定志賀毒素，或采用特異性核苷酸探針鑒定單菌落的stx基因[7]。STEC毒力復雜，大質粒上編碼溶血素的hlyA基因、編碼緊密粘附素的eae基因等，可增強STEC的毒力[7]。此種檢測STEC的多重PCR技術，可同時檢測stx2、hlyA兩種毒力基因和wzy基因。O抗原聚合酶基因wzy基因是O157血清型大腸桿菌的特異基因，可鑒別出O157菌株。O157是STEC最主要的血清型，也是STEC最常見的引起食物中毒的血清型。通過擴增這三組基因，不僅可區分出O157，還可鑒定出菌株的毒力情況，為流行病學研究和食品安全控制提供更全面的信息。本文報道的多重PCR技術，能滿足實際檢驗要求。多重PCR引物之間容易相互干擾，形成引物發夾環或引物二聚體，導致檢測靈敏度降低。多重PCR體系中hlyA基因擴增優于另兩組基因，可在后續試驗中繼續優化PCR體系和反應條件，以進一步提高stx2和wzy基因的檢測靈敏度。

[1]Mainil J G,Daube G.Verotoxigenic Escherichia coli from animals,humansandfoods：who’swho[J].JApplMicrobiol,2005,98(6)：1332-1344

[2]Law D.Virulence factors of Escherichia coli O157 and other Shiga toxin-producing E.coli[J].J Appl Microbiol,2000,88(5)：729-745

[3]Eklund M,Scheutz F,Siitonen A.Clinical isolates of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli：serotypes,virulence characteristics,and molecular profiles of strains of the same serotype[J].J Clin Microbiol,2001,39(8)：2829-2834

[4]Eklund M,Leino K,Siitonen A.Clinical Escherichia coli strains carrying stx variants and stx-positive virulence profiles[J].J Clin Microbiol,2002,40(12)：4584-4593

[5]周勇,萬成松.大腸桿菌O157：H7的毒力島與毒力因子的研究進展[J].微生物學免疫學進展,2006,34(2)：58-62

[6]Wang G H,Clark C G,Rodgers F K.Detection in Escherichia coli of the genes encoding the major virulence factors,the genes defining the O157：H7 serotype,and components of the type 2 Shiga toxin family by multiplex PCR[J].J Clin Microbiol,2002,40(10)：3613-3619

[7]羅霞，徐建國.產志賀毒素型大腸桿菌的研究進展[J].疾病監測，2006，21(4)：217-220

A Multiplex PCR System for the Detection of Shiga Toxin-producing Escherichia Coli in Food

LI Rui,DAI Shi-jiao,YANG Jing-jing,Qü Min，LIU Zhi-guo
（College of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei,China）

2010-04-13

李睿（1972—），女（土家），副教授，博士，現從事食品安全方向研究工作。