HPLC法測定血漿中奧美拉唑及其人體藥動學研究

譚文明 穆丹丹 儲小祥 丁黎

本實驗通過測定血漿中奧美拉唑的濃度觀察中國健康志愿者口服浙江雙偉制藥有限公司仿制的奧美拉唑腸溶膠囊(受試制劑)后的血藥濃度經時過程，估算其相應的藥代動力學參數，并以阿斯利康制藥有限公司生產的奧美拉唑腸溶膠囊(洛賽克)為參比制劑，估算受試制劑的相對生物利用度，為臨床用藥提供參考。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1100液相色譜儀，含:雙高壓泵，自動進樣器(帶溫控系統)，柱溫箱，紫外檢測器。色譜工作站:Agilent Chemstation(A.10.02)。TGL-16B高速離心機(上海安亭科學儀器廠);旋渦振蕩混和器(上海醫科大學儀器廠)。

1.2 藥品和試劑 奧美拉唑對照品由浙江省藥品檢定所標化，含量99.7%;尼美舒利對照品由浙江雙偉制藥有限公司提供，含量99.6%。奧美拉唑腸溶膠囊(浙江雙偉制藥有限公司，批號040320，20 mg/粒，受試制劑)。奧美拉唑腸溶膠囊(洛塞克)(阿斯利康制藥有限公司，批號0411005，20 mg/粒，參比制劑)。甲醇(色譜純，德國Merck公司);乙酸銨、冰乙酸、三乙胺為分析純;水為去離子純凈水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 色譜柱:Lichrospher ODS(25 cm×4.6 mm，淮陰漢邦科技有限公司);流動相:水(1%的冰醋酸+1%三乙胺)-甲醇 (37∶63，V/V)，流速:1.0 ml/min，柱溫:30℃，進樣器控制溫度:5℃，檢測波長:302nm;進樣量:10 l。

2.2 血漿樣品的處理 于10 ml離心管中精密加入內標溶液(10.52 μg/ml尼美舒利甲醇溶液)50 μl，以氮氣流吹干，精密加入血漿樣品1 ml，旋渦3秒混勻，加入6 ml乙醚，渦旋4 min，于4000 r/min離心10 min，吸取有機相轉移至另一10 ml玻璃離心管中，于室溫中氮氣流吹干，加入流動相100μl溶解殘渣，于16000 r/min離心2 min，吸取上清液轉移至自動進樣器樣品管中，進行HPLC分析。

2.3 數據分析 將所得血藥濃度-時間數據經自然對數轉換后，用最小二乘法對尾段相回歸計算消除速率常數k，Cmax及Tmax均為實測值;消除半衰期(t1/2)、曲線下面積(AUC)分別按下列各式估算:t1/2=0.693/k，AUC0-96=∑Ci+Ci-1)·(tit})/2，AUC0-∞=AUC0-96+C96/k，其中 C96為最后取樣點濃度，k為末端消除速率常數。

所得參數(Tmax、Cmax、AUC0-12、AUC0-∞)用交叉試驗設計的方差分析，其中 Cmax、AUC0-12、AUC0-∞經自然對數轉換后先進行方差分析，然后進行雙單側t檢驗(顯著性水平α=0.05)。

3 實驗結果

3.1 色譜行為及方法的專屬性 在本實驗所采用的HPLCUV條件下，奧美拉唑出峰時間在6.6 min左右，內標出峰時間在9.5 min左右。奧美拉唑和內標峰形良好，無雜峰干擾測定。本方法具有較高的特異性，能準確測定血漿中的奧美拉唑的濃度。

3.2 血漿中奧美拉唑標準曲線制備及靈敏度 取10 ml玻璃離心管數支，分別精密加入不同量的奧美拉唑標準液，加入空白血漿1 ml，渦旋混勻，配成含奧美拉唑分別為3.924、9.810、29.43、98.10、196.2、490.5、981.0、1962 ng/ml的標準血漿，按“2.2”項下操作，計算奧美拉唑峰面積As和內標峰面積Ai的比值f(f=As/Ai)，以f值對血藥濃度(C)作權重回歸計算，得回歸方程。不同5 d，每天做一條標準曲線，以f值的平均值對血藥濃度(C)作回歸計算，得回歸方程:f=0.0021756×C +0.0002889(權重系數 w =1/C，r=0.9998)，按上述條件測得奧美拉唑在血漿中的最低定量限為3.924 ng/ml(S/N≈10)。

3.3 回收率試驗(絕對回收率) 取10 ml玻璃離心管數支，分別取奧美拉唑標準液適量于離心管中，用甲醇配成濃度分別為9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的奧美拉唑甲醇溶液，每份1 ml，每種濃度配制2份。加入內標溶液50 μl，渦旋混勻，氮氣流吹干，加入流動相100μl溶解殘渣，于16000 r/min離心2 min，吸取上清液轉移至自動進樣器樣品管中，進行HPLC分析，計算樣品和內標的峰面積比值fs(fs=As/Ai)。

取10 ml玻璃離心管數支，分別精密加入不同量的奧美拉唑溶液適量，精密加入1 ml空白血漿，渦旋混勻，配成含奧美拉唑 9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的血漿，每種濃度各做5份樣品。加入乙醚6 ml，渦旋4 min，于4000r/min離心10 min，精密吸取有機相4.5 ml置10 ml玻璃離心管中，加入內標溶液50 μl，渦旋混勻，室溫中以氮氣流吹干，加入流動相100 μl溶解殘渣，于16000r/min離心2 min，吸取上清液轉移至自動進樣器樣品管中，進行HPLC分析，計算樣品和內標的峰面積比值fx(fx=As/Ai)，將上述fx和fs的比值代入公式R%=(fx×6)/(fs×4.5)即可求得奧美拉唑的絕對回收率(R%)。高中低4 個濃度 9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml奧美拉唑血漿的絕對回收率分別為82.3%、84.1%、87.8%、90.7%。

3.4 準確度試驗(相對回收率) 取10 ml玻璃離心管數支，按標準曲線配制方法制備含奧美拉唑濃度分別為9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的含藥血漿，每個濃度做 5 份，按“血漿樣品的處理”項下操作，計算奧美拉唑峰面積As和峰面積Ai的比值，將該比值代入當天隨行標準曲線方程，計算所得濃度與加入濃度的比值即為相對回收率，高中低4個濃度9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml奧美拉唑血漿的準確度分別為91.0%、94.4%、95.6%、99.1%。

3.5 精密度試驗 取10 ml玻璃離心管數支，按標準曲線配制方法制備含奧美拉唑濃度分別為9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的含藥血漿(每個濃度做5份樣品)及一條隨行標準曲線，按“2.2”項下操作。每天配制一批及一條隨行標準曲線，連續做3 d，共三批，每批每個濃度做5份樣品，計算奧美拉唑峰面積As和內標峰面積Ai的比值f，代入當天的標準曲線求得實測濃度，計算批內和批間精密度。9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的含藥血漿的批內和批間精密度分別為11.3%和11.9%，4.4%和10.0%，2.9%和8.2%，1.2%和2.1%。

3.6 穩定性試驗 取10 ml玻璃離心管數支，按標準曲線配制方法制備含奧美拉唑濃度分別為9.81、98.1、490.5、1962 ng/ml的含藥血漿，每種濃度各配制15 ml，然后精密吸取10份，每份1 ml。2份于配制好后按“2.2”項立即分析;2份配制好后反復凍融兩次后分析;2份于室溫放置8 h后分析;2份配制好后放入-20℃冰箱中冷凍保存6 d后取出化凍后分析;在試驗期間上述儲藏條件經反復凍融不影響血漿中奧美拉唑的含量測定。2份按血樣處理方法項下處理，處理后的樣品在放置0、1、6、12 h后進樣分析，進樣樣品在5℃自動進樣器中穩定性良好。

3.7 方法質量控制(隨行標準曲線及質控樣品) 受試者血漿樣品的測定在分析方法確證完成之后進行。在每批血漿樣品測定的同時建立相應的標準曲線(即隨行標準曲線)及質控樣品，隨行標準曲線的配制方法見“3.2”項下，質控樣品為含奧美拉唑濃度分別為9.81、98.1、490.5、1962 ng/ml的標準含藥血漿，每批血漿樣品的濃度數據用隨行標準曲線求得，根據高、中、低4個濃度質控樣品的準確度測定結果分別為96.7%、100.6%、100.1%、99.7%，即評判該批樣品的測定數據可被接受。

3.8 藥動學研究 20名受試者分別口服參比和供試兩種制劑20 mg后的奧美拉唑平均血藥濃度-時間曲線見圖1。

圖1 受試者分別口服兩種制劑20 mg后的奧美拉唑平均血藥濃度-時間曲線

采用中國藥科大學藥代中心楊勁教授編寫的BAPP2.0軟件計算主要藥動學參數，奧美拉唑腸溶膠囊受試制劑和參比制劑的t1/2分別為(2.22±0.77)h和(1.96±0.48)h，達峰濃度分別為(481.6±306.7)ng/ml和(492.7±325.2)ng/ml，達峰時間分別為(2.6±1.0)h和(2.8±0.9)h。以AUC0-12計算的受試奧美拉唑腸溶膠囊的相對生物利用度(99.4±13.8)%，臨床實驗的藥動學統計數據表明兩種奧美拉唑膠囊生物等效。

對兩種制劑口服后的奧美拉唑參數 Cmax、AUC0-τ和AUC0-∞經自然對數轉換后，先進行方差分析，再進行雙單側t檢驗，結果表明，兩種制劑的上述參數生物等效，其Tmax經非參數法檢驗無顯著性差異(P＞0.05)，表明這兩種制劑生物等效。

4 討論

4.1 奧美拉唑穩定性 奧美拉唑結構中含有亞砜基使其穩定性降低，對光、濕、酸等條件敏感，其在堿性條件下是穩定的，在酸性條件下不穩定。筆者在血漿樣品的前處理及測定過程中都注意避光，具體做法為將自動進樣器用黑紙遮蔽并將溫度設定在5℃。對于抽取的受試者血漿樣本及時提取，在7 d內測定完畢。

4.2 奧美拉唑腸溶膠囊人體藥代動力學特點 奧美拉唑腸溶膠囊由一個個非常小的腸衣微顆粒組成，在小腸內才被崩解吸收，本實驗第0.5 h取樣點平均血濃僅為10ng/ml是Cmax的1/30，甚至有5名受試者血濃低于檢測限，血藥濃度吸收曲線體現了受試、參比腸溶制劑在人體消化道中正確的吸收過程。

奧美拉唑腸溶膠囊(洛賽克)說明書指出奧美拉唑存在腸肝循環，本次實驗中60%受試者服藥后其血藥濃度曲線存在“雙峰”現象是奧美拉唑存在腸肝循環的體現。

［1］丁黎，楊勁，閆花麗，等.人血漿中奧美拉唑高效液相色譜測定法及其藥代動力學研究.藥物分析雜志，1999，19(5):300-303.

［2］付良青，黃豐，吳政德，等.中國健康志愿者的奧美拉唑及代謝產物的藥代動力學.中國藥理學與毒理學雜志，2003，17(1):51-54.