ERCC1基因多態性與晚期非小細胞肺癌患者鉑類化療療效的關系

王敬慧 張權 張卉 王群慧 楊新杰 顧艷斐 張樹才

肺癌居癌癥相關死亡病因的首位，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌的80%，2/3的患者確診時已為晚期。含鉑兩藥化療方案是NSCLC的標準一線治療，客觀緩解率約為30%-40%，中位生存期為8個月-10個月，1年生存率為30%-40%。順鉑是肺癌化療方案的基本藥物之一，通過與DNA形成交聯復合物抑制DNA合成和轉錄，從而起到抗腫瘤的作用。切除修復交叉互補組1（excision repair cross-complementing group 1, ERCC1）是核苷酸切除修復途徑的重要成分，通過對鉑類-DNA復合物的切除修復而影響鉑類藥物的療效。研究顯示ERCC1 C8092A和第118位密碼子位點單核苷酸多態性（single-nucleotide polymorphism, SNP）在預測晚期NSCLC患者鉑類化療療效方面有一定的價值，但研究結果仍存在爭議。本研究通過對晚期NSCLC患者化療前外周血基因組ERCC1 C8092A、118密碼子基因型進行分型，探討C8092A、密碼子118多態性與含鉑化療療效的關系，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2008年5月-2009 年 5月期間在北京胸科醫院腫瘤內科經細胞學或組織學確診的晚期NSCLC初治患者90例：中位年齡55歲（33歲-73歲）；男性63例，女性27例；腺癌69例，鱗癌20例，腺鱗癌1例；IIIb期30例，IV期60例。全部患者均接受含順鉑兩藥方案化療，中位化療周期數為4周期。方案：順鉑/紫杉醇40例、順鉑/長春瑞濱7例、順鉑/吉西他濱36例、順鉑/培美曲噻7例，隨訪日期截至2009年7月31日，77例患者出現疾病進展，其余13例未進展。

1.2 實驗方法 DNA提取，化療前采用EDTA抗凝負壓管抽取靜脈血標本3 mL-5 mL，Miller法提取外周血基因組DNA。引物序列：C8092A：上游引物5’-ACAGT GCCCCAAGAGGAGAT-3’，下游引物5’-AGTCTCTGG GGAGGGATTCT-3’，擴增產物204 bp；ERCC1 118：上游引物5’-CCAGAACACTGGGACAT-3’，下游引物5’-TCAGAGGATCAGGGACT-3’，擴增產物399 bp。引物由北京賽百盛生物公司合成。PCR反應條件：C8092A：95oC、5 min，95oC、30 s，59oC、30 s，72oC、45 s，35個循環，72oC、10 min；ERCC1 118：95oC、5 min，95oC、30 s，54oC、30 s，72oC、45 s，35個循環，72oC、10 min。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳后經紫外凝膠成像系統拍照。將有陽性結果的PCR產物進行測序，應用Bioedit軟件對測序結果與ERCC1基因組序列進行比對，確認ERCC1基因C8092A、118位點基因型，測序由北京天根生化科技有限公司完成。

1.3 療效評價及生存記錄 按RECIST標準進行療效評價：完全緩解（complete response, CR）：所有目標病灶消失且持續4周；部分緩解（partial response, PR）：腫瘤最大徑之和至少減少30%，并保持4周以上；疾病進展（progressive disease, PD）：基線病灶長徑總和增加≥20%或出現新病灶；病灶穩定（stable disease, SD）：縮小未達PR或增加未到PD；CR和PR者需經4周后確認。參考國內外同類研究，設定CR+PR為有效，SD+PD為無效。以進入研究起始時間為起點，疾病進展時間作為終點記錄患者無進展生存期（progression free survival, PFS）。對于在隨訪截止日期無進展的病例，在統計時作為刪失數據處理。

1.4 統計處理 采用SPSS 10.0進行數據處理。率的比較采用χ2檢驗和Fisher's精確概率檢驗進行分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，各因素水平間比較用Log-rank分析，Cox回歸模型分析預后相關因素。所有統計檢驗均為雙側概率檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ERCC1 C8092A、118基因型頻率 90例晚期NSCLC患者ERCC1 C8092A位點存在3種等位基因型，基因頻率分別為：CC 40.0%（36/90）、CA 48.9%（44/90）、AA 11.1%（10/90）；ERCC1 118存在3種等位基因型，基因頻率分別為：CC 58.9%（53/90）、CT 34.4%（31/90）、TT 6.7%（6/90）。不同年齡、性別、吸煙狀況、病理類型、臨床分期患者間ERCC1 C8092A、118多態性均無統計學差異（P＞0.05）。

2.2 ERCC1 C8092A、118多態性與療效的相關性 90例晚期NSCLC患者經療效評價后，0例CR，27例（30.0%）PR，50例（55.6%）SD，13例（14.4%）PD，總有效率（CR+PR）為30.0%。ERCC1 C8092A CC基因型患者化療有效12例，無效24例，CA+AA基因型化療有效16例，無效38例，CC和CA+AA患者療效間無統計學差異（P=0.71）。ERCC1 118 CC基因型化療有效17例，無效36例，CT+TT基因型患者化療有效9例，無效28例，CC和CT+TT患者療效間無統計學差異（P=0.43）（表1）。C8092A、118多態聯合分析顯示，ERCC1兩個位點同為CC基因型患者療效與其它基因型患者比較無統計學差異（P=0.12）（表2）。

2.3 ERCC1 C8092A、118多態性與PFS的相關性 ERCC1 C8092A CC基因型患者的中位PFS為5.2個月，CA或AA基因型患者的中位PFS為5.4個月，Log-rank分析無統計學差異（P=0.62）（圖1A）；ERCC1 118 CC基因型患者中位PFS為5.5個月，CT或TT基因型患者中位PFS為5.3個月，Log-rank分析無統計學差異（P=0.59）（圖1B）；ERCC1 C8092A、118聯合多態性與PFS無關（P=0.42）。經Cox回歸多因素分析，ERCC1 C8092A、118多態性均不是晚期NSCLC患者PFS的獨立因素。

表1 晚期NSCLC患者ERCC1 C8092A、118多態性與含鉑化療療效的關系Tab 1 Genotype frequencies in patients with advanced NSCLC and response to cisplatin-based chemotherapy according to genotype

表2 晚期NSCLC患者ERCC1 C8092A、118多態聯合與含鉑化療療效的關系Tab 2 Genotype frequencies in patients with advanced NSCLC and response to cisplatin-based chemotherapy according to combination of genotype in C8092A and 118

3 討論

SNP是基因水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，包括單堿基轉換、顛換以及單堿基插入或缺失等形式，是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90%以上。基因序列中單個堿基的變異引起編碼的氨基酸發生改變，從而影響基因表達的蛋白質的功能。SNP與許多疾病的易感性及治療療效等相關。DNA修復基因包括核苷酸切除修復基因、堿基切除修復基因、DNA鏈斷裂修復基因、錯配修復基因和直接逆轉損傷的修復基因等。DNA修復能力是影響鉑類療效的重要原因，其中核苷酸切除修復與鉑類藥物耐藥最為密切，ERCC1基因在核苷酸切除修復途徑中起重要作用[1]。C8092A和第118位密碼子是ERCC1基因多態性被研究最為廣泛的兩個位點。C8092A位于ERCC1基因的3’非編碼區，可能與ERCC1 mRNA翻譯有關。ERCC1第118位密碼子基因C型變異為T型，核苷酸序列由AAC變為AAT，雖然沒有導致氨基酸的替代，生成的仍為天冬酰胺，但會影響ERCC1 mRNA和蛋白水平及/或導致與其它功能性SNPs的連鎖不平衡，使個體對鉑類藥物的敏感性產生差異，影響鉑類藥物療效[2]。Park等[3]證明ERCC1 118 C變異為T，CT或TT等位基因使ERCCl mRNA水平增高，DNA修復能力增強，患者對鉑類藥物的敏感性降低，野生型基因（CC）患者對含鉑化療更敏感。

圖1 ERCC1 C8092A（A）和118（B）各基因型PFS比較Fig 1 Kaplan-Meier curves of PFS according to ERCC1 C8092A (A) and 118 (B)genotypePFS: progression free survival.

本文前瞻性研究90例EERCC1基因C8092A、第118位密碼子多態性能否預測接受含鉑化療晚期NSCLC患者的療效，結果發現，90例晚期NSCLC患者ERCC1基因C8092A三種基因型頻率分別為40.0%（CC）、48.9%（CA）、11.1%（AA），第118位密碼子的三種基因型頻率分別為 58.9%（CC）、34.4%（CT）、 6.7%（TT），兩種基因型多態性在不同年齡、性別、吸煙狀況、病理類型、臨床分期間均無統計學差異。本文結果顯示，C8092A各基因型有效率相近，118密碼子CC基因型有效率高于CT及TT基因型，但二者多態性與療效均無統計學差異。ERCC1 C8092A和118各基因型的PFS相近，兩個位點多態性與PFS均無相關性。多態性聯合分析結果提示兩個位點同時為CC基因型的有效率達46.7%，明顯高于其它基因型組合，但無統計學差異，值得擴大樣本進一步研究。

國內袁芃等[4]檢測了200例接受含鉑方案化療的晚期NSCLC患者ERCC1基因C8092A多態性，多態性與療效（CR+PR與SD+PD比較）不相關。柳艷飛等[5]報告94例接受紫杉醇聯合順鉑化療的晚期NSCLC患者第118位密碼子各基因型與臨床受益率及1年生存率差異均無統計學意義。高長明等[6]報告57例接受吉西他濱聯合順鉑化療的晚期NSCLC患者的第118位密碼子CC基因型療效高于CT基因型（有效率分別為46.4%、23.1%），但無統計學差異。意大利作者Tabldi等[7]報告，65例接受順鉑聯合吉西他濱治療的晚期初治NSCLC患者的118多態性與療效及預后不相關。西班牙Delas等[8]報告，135例接受順鉑、吉西他濱化療的晚期NSCLC患者118多態性與患者的預后無關。但也有不同的研究結果。Zhou等[9]研究了128例接受含鉑方案化療NSCLC患者ERCC1基因C8092A 位點的多態性，發現CC基因型患者MST為22.3個月，CA和AA基因型患者MST為13.4個月（P=0.006）。Su等[10]對76例接受含鉑化療的晚期NSCLC患者研究時發現，ERCC1 118 CC基因型與化療療效顯著相關，比含T（TT+CT）等位基因患者化療的有效率高（OR=4.10, 95%CI 1.31-12.85）。韓國Ryu等[11]研究發現109例晚期NSCLC接受含順鉑聯合方案化療患者118密碼子各基因型間的療效無差異，但CC基因型患者的生存期顯著長于TT或CT基因型患者（MST分別為486天和281天，P=0.005 8）。西班牙Isla等[12]報告，62例多西紫杉醇聯合順鉑治療的晚期NSCLC患者118密碼子CC基因型的預后顯著優于CT或TT基因型患者。希臘Kalikaki等[13]報告接受含鉑化療的晚期NSCLC患者ERCC1基因C8092A多態性與生存顯著相關，CA或AA基因型患者生存期顯著優于CC基因型（MST分別為9.8個月和14.1個月，P=0.009），118密碼子多態性與療效（CR+PR與SD+PD比較）相關，含C基因型患者（CC、CT）有效率顯著高于TT基因型（P=0.012）。

各研究結果的不一致可能受入組病例數、化療方案、基因型檢測方法等因素影響，也與不同種族基因型頻率分布顯著不同有關[14]。ERCC1基因多態性影響晚期NSCLC患者鉑類化療療效及生存期的機制尚未完全闡明，如果將ERCC1 mRNA以及蛋白表達共同融合到ERCC1 C8092A、118密碼子基因多態性研究中，探討其相互影響的機制，可能有助于闡明ERCC1多態性對基因轉錄和蛋白質翻譯的作用。ERCC1基因多態性能否為個體化治療提供選擇藥物的依據，還需要進行更大樣本更嚴謹的臨床研究來明確RCC1基因多態性對晚期NSCLC患者含鉑化療療效及生存的作用。

本試驗樣本量不是非常大，化療方案較多，可能對結果有些影響。因本組患者隨訪期不長，本文僅對ERCC1多態性與PFS的關系作了探討，尚不能進行ERCC1多態性預測患者生存期的分析，我們將繼續對全組患者進行隨訪，并在今后對ERCC1基因多態性與晚期NSCLC患者生存的關系作出評價。