重組人血管內皮抑制素聯合放射治療對lewis肺 癌小鼠的作用

何渡 戈偉 李長虎 趙振宇 徐細明 楊芳

肺癌是國內外發病率與死亡率都非常高的惡性腫瘤，放射治療是治療肺癌的主要手段之一，但是單純的放射治療的效果尚不理想。因此，國內外一直在試圖探尋一種新的、有效的聯合治療手段來提高放療的療效。本研究將已經在國內上市的抗血管生成藥物——重組人血管內皮抑素（rh-endostatin，YH-16，恩度）與放療聯合，與傳統的放療方法和單獨使用重組人血管內皮抑制素的方法進行療效對比，觀察對lewis肺癌小鼠生長及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試劑 新生小牛血清購自杭州四季青公司，DMEM培養基及胰蛋白酶購自GIBCO公司，重組人血管內皮抑制素由先聲藥業公司提供，鼠VEGF抗體和鼠CD34 lgG購自武漢博士德生物公司。

1.1.2 動物 lewis肺癌細胞，中國科學研究院藥理研究所提供；6周-8周、體重18 g-20 g的雌性C57 BL/6小鼠40只，購自武漢大學試驗動物中心。

1.1.3 儀器設備 山東新華Fcc-8000F型Co60治療機，美國SHELDM2300型二氧化碳培養箱，北京海博川科技有限公司超凈工作臺，日本Olympus IMT-2倒置相差顯微鏡，HPLAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統。

1.2 方法

1.2.1 動物模型與相應處理 將生長良好的lewis肺癌細胞制成1×107個/mL細胞懸液，0.2 mL/只接種于每只預先經脫毛和消毒的小鼠右后肢大腿腹側。用游標卡尺測量腫瘤的最長直徑和最短直徑，并取其平均值，當腫瘤長至0.8 cm時將40只小鼠隨機分為四組，每組10只。A組為空白對照組，每日尾靜脈注射生理鹽水0.1 mL；B組為重組人血管內皮抑素組，每日尾靜脈注射濃度為10%的重組人血管內皮抑素0.1 mL，共15天；C組為放療組；D組為聯合組，每日尾靜脈注射濃度為10%重組人血管內皮抑素0.1 mL（20 μg），共15天，在第6天-10天時給予放療。

在放療時，小鼠先用乙醚麻醉，待藥物顯效后將小鼠固定在自制的木板上，在右側腹股溝腫瘤區給予Co60照射，劑量率為113 cGy/min，腫瘤區覆蓋0.5 cm的組織等效材料，源皮距SSD為80 cm，劑量10 Gy/5次，5次/周。

1.2.2 腫瘤體積及抑瘤率的測定 隔日一次用游標卡尺測量荷瘤小鼠最長徑a（mm）和最短徑b（mm），根據公式V=ab2/2計算腫瘤體積（V），并繪制腫瘤生長曲線。在處理結束后第10天處死小鼠，剝離瘤體，稱重，計算抑瘤率。

抑瘤率=（對照組瘤質量-試驗組瘤質量/對照組瘤質量）×100%。

1.2.3 VEGF測定 腫瘤標本取下后立即用10%的中性甲醛固定4 h-8 h，脫水，石臘包埋后切片，應用常規免疫組織化學（SP法）檢測VEGF的表達。結果判斷：VEGF的陽性染色為胞質著色。光鏡下可見細胞胞漿內出現棕黃色顆粒，棕黃色越多，染色越深，其表達也越強。采用HPLAS-1000彩色病理圖文分析系統處理圖片。

1.2.4 微血管計數（microvessel density, MVD） 參照Veidner等報道的方法進行微血管計數。

1.2.5 統計學處理 應用SPSS 13.0統計分析軟件進行分析，計量資料的均數以Mean±SD表示；多組均數比較方差齊性時采用單向方差分析，均數間兩兩比較采用q檢驗，方差不齊時則用非參數檢驗，以P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 不同治療組對lewis肺癌小鼠生長的影響及抑瘤率 在接種的第7天-9天時接種部位可及黃豆大小的硬塊，腫瘤體積隨著時間的增加逐漸變大，其中對照組腫瘤生長最為迅速，重組人血管內皮抑素組、放療組和聯合組三組的腫瘤生長都有不同程度的減慢（圖1）。荷瘤小鼠處死后，聯合組瘤質量的平均值明顯低于其它三組（P＜0.05），抑瘤率為63.34%±4.89%（表1），高于重組人血管內皮抑素組和放療組（P＜0.05），結果顯示聯合處理的抑瘤作用最強。

2.2 不同治療組對VEGF的影響 免疫組化結果表明，腫瘤組織VEGF的陽性表達主要分布于胞漿，四組均可見VEGF的陽性表達，放療組VEGF著色較深，呈強陽性表達（VEGF平均灰度值=146.67±2.29），重組人血管內皮抑素組和聯合組VEGF著色均較對照組淺，其中聯合組VEGF灰度值僅為42.13±3.59，與其它三組比較有統計學差異（P＜0.01）（圖2）。

2.3 不同治療組對腫瘤微血管密度的作用 鏡下觀察，可見放療組的血管增生明顯（MVD=39.44±1.12）且可見血管基底膜不完整。重組人血管內皮抑素組（MVD=12.78±0.97）和聯合組（MVD=6.22±0.36）血管生成減少，MVD值低于對照組（P＜0.05），且血管基底膜較完整。其中聯合組新生血管生成極少（MVD=6.22±0.36），明顯低于其它三組（P＜0.05）（圖3）。

3 討論

圖1 荷瘤小鼠治療期間的腫瘤體積變化Fig 1 The volume change in the rats with lung cancer during treatment

實體瘤因缺氧而導致新生血管的形成是腫瘤生長和轉移的基礎，同時也是腫瘤預后不良的重要因素[1]。近年來有學者提出的抗血管生成治療有望成為抑制腫瘤生長又一突破口，并逐漸成為腫瘤研究領域所關注的新的熱點[2]。目前內皮抑素（endostatin）是最強的血管生成抑制因子，在體內試驗中，從大腸桿菌中得到的重組鼠內皮抑素蛋白，已經發現通過每天給藥可以抑制異位移植鼠如lewis肺癌、T241骨纖維肉瘤或B16F10黑色素瘤的生長[3]。最近也有研究[4]報道經腺病毒轉染的內皮抑素對lewis肺癌小鼠的生長和轉移有明顯的抑制作用。

圖2 四個治療組VEGF免疫染色（SP, ×200）Fig 2 Immuno-staining of VEGF in four groups (SP, ×200)VEGF: vascular endothelial growth factor.

圖3 四個治療組經過CD34染色的腫瘤微血管（SP, ×200）Fig 3 Tumor microvessel density in four group marked by CD34(SP, ×200)

目前的研究表明，在人體環境中，腫瘤可能存在數月或者數年，已經建立了一個可能對抗血管生成治療并不敏感的血管系統，因此會影響臨床治療腫瘤療效，因此學者們嘗試將抗血管生成治療和其它治療聯用以提高腫瘤治愈率。國內王金萬、孫燕等[6]率先將重組人血管內皮抑素和NP方案聯用治療非小細胞肺癌，結果發現重組人血管內皮抑素+NP方案組較單用NP方案組有效率（response rate, RR）提高了16.1%，中位疾病進展時間（time to progression, TTP）也延長了2.9個月，表明重組人血管內皮抑素與NP方案具有協同作用，且不明顯增加化療的不良反應。本研究也表明重組人血管內皮抑素和放療對抑制腫瘤生長和瘤質量有一定影響，但是聯合組抑制作用更為顯著，提示抗血管生成治療和其它治療（如放療）聯用可能是增加其療效的有效途徑。傳統的治療方法和抗血管生成治療的聯合可以通過靶向作用于腫瘤細胞和內皮細胞，從而提高腫瘤療效。這種聯合治療策略的其中一個優勢在于可以減低個體的藥物劑量，但并不減弱抗腫瘤的療效。已經有研究[1]表明血管生成治療和化療聯用可以增加化療藥物在腫瘤組織中的藥物濃度。關于抗血管生成治療和放射治療聯用治療腫瘤目前已經有一些相關的研究報道，Luo等[7]通過構建pXLG-mEndo質粒研究內源性小鼠內皮抑素聯合放療對肺癌模型的影響，試驗表明，與其它組相比，pXLG-mEndo+放療組提高了腫瘤組織內內皮抑素的水平，且小鼠的腫瘤生長得到了顯著的抑制。Shibuya研究[8]也表明ZD6474（一種抗血管生成藥物）可以降低腫瘤組織中VEGF及EGFR的表達水平，從而增加了非小細胞肺癌對放療的敏感性。

對于局部晚期非小細胞肺癌，放療為其主要治療手段，但是這類患者經放療后5年生存率仍不令人滿意。2002年10月重組人血管內皮抑素正式進入II期臨床試驗，同年Miren等[9]將人重組內皮抑素注入到51b-CC小鼠體內，結果發現腫瘤體積降低了40%。且2004年蘇黎紅等[10]研究重組人血管內皮抑素對荷瘤小鼠的影響，并確定了治療小鼠的有效劑量及用藥時間。這些試驗數據為本研究的順利進行提供了試驗基礎。

本研究中放療組VEGF的表達（146.32±2.29）和MVD （39.44±1.12）水平與對照組相比顯著增加，表明放療可以提高腫瘤組織VEGF的表達水平，進而刺激腫瘤新生血管生成。Inoue研究[11]也發現直腸癌病人放療后VEGF表達明顯增加。其具體機制有待于進一步研究，可能與放療引起乏氧細胞的比率增加有關，但是新生血管的增加并不一定相應地增加血流量和氧的供應，這是由于腫瘤的新生血管是異常的，新生血管內皮細胞與正常的血管相比有不同表型和功用，同時VEGF可以保護內皮細胞免受放射線的損傷，這些都是產生放射耐受的重要原因。Jain[12]提出抗血管治療可以導致腫瘤血管在被破壞之前“正?；??！罢；钡哪[瘤血管與正常血管功能相似，使腫瘤氧水平高，乏氧得以改善，減少對放療耐受的乏氧細胞的數量，提高了腫瘤細胞對放射的敏感性。本研究中聯合組瘤質量（0.921±0.135）、MVD（6.22±0.36）和VEGF（42.13±3.59）的表達與其它三組相比均有明顯下降，而且腫瘤血管的形態接近于正常的血管，表明重組人血管內皮抑素可能是通過使血管“正?；?，減少乏氧細胞的數量，從而使VEGF的表達下調，增加放療敏感性。

綜上所述，重組人血管內皮抑素聯合放療可以明顯抑制lewis肺癌小鼠的腫瘤生長，通過間接下調VEGF的表達可能為其有效的途徑之一。但是關于兩者聯合治療的時序問題尚需進一步研究，本實驗研究結果將為今后的關于抗血管生成治療和放療治療聯合運用提供實驗依據，有助于進一步完善腫瘤治療的臨床解決方案。