RASSF1A基因甲基化與非小細胞肺癌預后的相關性研究

張卉 張樹才 張宗德 賈紅彥 古淑香 趙丹

近年來隨著表觀遺傳學的發展，研究發現DNA甲基化在真核生物基因表達調控中起著重要的作用。在肺癌組織中，已經發現一系列抑癌基因存在啟動子區異常高甲基化所導致的失活現象。其中部分抑癌基因的高甲基化與腫瘤發生、病情進展和預后密切相關，提示基因的甲基化可能是肺癌診斷、治療和預后評價的生物學標志之一。

自2000年Dammann等[1]從人染色體3p21.3區域分離鑒定出RASSF1A并確定其為一新型抑癌基因至今，已有多篇文獻報道RASSF1A啟動子區高甲基化與肺癌患者預后相關。國內亦有關于RASSF1A在腫瘤組織中表達異常的報道，但與肺癌預后相關性報道較少，因此我們就非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中RASSF1A異常甲基化與患者生存預后進行了臨床研究。

1 材料與方法

1.1 材料 所取病例標本為1999年-2000年北京胸部腫瘤結核病醫院胸外科進行手術切除的150例NSCLC組織和20例肺部良性病變組織。手術切除組織標本即刻-70oC低溫保存。每例腫瘤組織標本均經高倍境下確定腫瘤細胞≥80%。所有病例術前均未經放療和化療。150例NSCLC病例中男性121例，女性29例；年齡為31歲-78 歲，平均年齡為（59±9）歲；其中腺癌40例，鱗癌102例，腺鱗癌8例；根據世界衛生組織（WHO）的標準：腫瘤TNM分期為I期49例，II期32例，IIIa期48例，IIIb-IV期21例，腫瘤分化程度為低分化62例，中分化58例，高分化30例。

1.2 DNA提取 酚/氯仿抽提法。

1.3 DNA的亞硫酸氫鹽修飾 取1 μg-2 μg基因組DNA，加雙蒸水至50 μL，加入5 μL 3 mol/L的NaOH 37oC變性30 min；加入520 μL新配制的3 mol/L亞硫酸氫鈉（pH5.0）和30 μL 10 mmol/L的對苯二酚，50oC保溫16 h；純化回收DNA（Qiaquick gel extraction kit）。

1.4 巢式甲基化特異性的PCR（methylation-specific polymerase chain reaction, MS-PCR） 取亞硫酸氫鹽修飾后DNA 1 μL為模板，以經Sss I酶修飾的Hep-2細胞DNA為陽性對照，水為陰性對照。引物由北京賽百盛生物公司合成并純化（表1）。采用沉降PCR和熱啟動PCR。PCR反應體系為25 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，DMSO 1.2 μL，2×Taq PCR Master Mix（天根生化科技有限公司）12.5 μL，最后加去離子水補齊至25 μL。第一輪擴增循環參數：94oC 3 min后，94oC 30 s，46oC-53oC 50 s，72oC 1 min，27次循環，72oC延伸10 min。第二輪擴增參數：94oC 3 min后，94oC 30 s，58oC-65oC 50 s，72oC 1 min，37次循環，72oC延伸10 min。

1.5 結果記錄 將25 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外線凝膠成像及分析系統（BIO-RAD公司）下掃描拍照，記錄結果。

1.6 產物測序 將PCR產物進行膠回收（Qiaquick gel extraction kit），連接轉化涂板，挑取陽性克隆送公司測序。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，相關性以χ2檢驗和Fisher's精確檢驗進行分析；生存資料分析采用Kaplan-Meier法，各因素水平間比較用Log-rank分析，分析預后相關因素使用Cox回歸模型，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RASSF1A啟動子區甲基化狀態 150例NSCLC中58例RASSF1A啟動子區高甲基化，發生甲基化率為38.7%；20例肺部良性病變中無1例RASSF1A啟動子區高甲基化（圖1）。

2.2 RASSF1A啟動子區甲基化與臨床病理因素之間的關系RASSF1A啟動子區高甲基化與年齡、性別、吸煙指數、腫瘤TNM分期均不相關，但與開始吸煙年齡、腫瘤分化程度相關。20歲前開始吸煙的NSCLC患者RASSF1A啟動子甲基化率（56.7%）高于20歲后開始吸煙的NSCLC患者（28.2%）（P=0.006）；低分化NSCLC患者RASSF1A啟動子甲基化率（51.6%）高于中分化（31.0%）和高分化（26.7%）NSCLC患者，差異有統計學意義（P=0.022,P=0.024），但中分化和高分化NSCLC之間差異無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

2.3 術后生存時間與RASSF1A啟動子甲基化相關性 150例NSCLC術后中位生存期為33個月，58例RASSF1A啟動子區高甲基化，術后中位生存期為22個月，92例未發現RASSF1A啟動子區高甲基化，術后中位生存期為57個月（P=0.004）（圖2A）；49例I期NSCLC術后中位生存期為80個月，13例RASSF1A啟動子區甲基化，術后中位生存期為58個月，36例未發現RASSF1A啟動子區高甲基化，術后中位生存期為80個月（P=0.022）（圖2B）；32例II期NSCLC術后中位生存期為32個月，12例RASSF1A啟動子區高甲基化，術后中位生存期為24個月，20例未發現RASSF1A啟動子區高甲基化，術后中位生存期為80個月（P=0.023）（圖2C）；48例IIIa期NSCLC術后中位生存期為23個月，24例RASSFA啟動子區高甲基化，術后中位生存期為18個月，24例未發現RASSF1A啟動子區高甲基化，術后中位生存期為31個月（P=0.036）（圖2D）；21例IIIb-IV期NSCLC中，9例RASSF1A啟動子區高甲基化，術后中位生存期為15個月，12例未發現RASSF1A啟動子區高甲基化，術后中位生存期為15個月（P=0.118）（圖2E）。

表1 RASSF1A啟動子區甲基化特異性PCR擴增引物序列Tab 1 MSP primer sequence of RASSF1A promter

圖1 腫瘤組織、良性病變及癌旁正常組織甲基化特異性PCR產物電泳結果Fig 1 Methylation analysis of RASSF1A by MSP in tissue of tumor, benign lesion and normal tissueT1: begin lesion; T2: normal tissue; T3 and T4: lung cancer tissue; P: positive control; N: negative control; U, amplified product with primers recognizing the unmethylated sequences; M: amplified product with primers recognizing the methylated sequences.Hep-2 DNA methlated with Sss I methyltransferase as a positive control and distilled water was used as a negative control.

表2 RASSF1A啟動子甲基化與臨床病理因素之間的關系Tab 2 Association between methylation of RASSF1A promoter and clinicopathologic variables

2.4 RASSF1A啟動子區高甲基化是NSCLC術后的一個獨立預后相關因素 利用Cox回歸模型，分析NSCLC中的各種因素（年齡、組織類型、分化程度、TNM分期、吸煙、開始吸煙年齡、甲基化狀態等），發現除病理分期外RASSF1A啟動子區甲基化狀態也是一個與NSCLC術后預后有關的因素（RR=1.584, 95%CI: 1.040-2.411, P=0.032）（表3）。

圖2 NSCLC術后RASSF1A甲基化狀態相關生存曲線Fig 2 Survival curves with reference to RASSF1A promoter methylationA: Overall survival curves for all 150 NSCLC cases; B: Survival curves for patients with 49 NSCLC cases (Stage I); C: Survival curves for patients with 32 NSCLC cases (Stage II); D: Survival curves for patients with 48 NSCLC cases(Stage IIIa); E: Survival curves for patients with 21 NSCLC cases (Stage IIIb and IV).

3 討論

目前已有大量文獻報道了在NSCLC、小細胞肺癌、乳腺癌、腎癌、食道癌[2]、前列腺癌、膠質瘤[3]等多種腫瘤中存在RASSF1A啟動子區高甲基化。現已明確抑癌基因RASSF1A在肺癌等腫瘤中表達失活的機制是由于啟動子區CpG島的特異性高甲基化所致。雖然抑癌基因的失活也可由突變所致，但對該基因的研究結果顯示，RASSF1A的突變率還不及10%，而RASSF1A啟動子區發生高甲基化的比率在小細胞肺癌、NSCLC細胞系中分別高達72%-100%、36%-88%，在NSCLC中啟動子區高甲基化達30%-45%[4-7]，同時非惡性組織肺組織中無一例發生甲基化。在研究中還發現，RASSF1A啟動子高甲基化與肺癌腫瘤細胞分化程度、開始吸煙年齡有關[8,9]，本實驗研究結果與之相同。這一結果從側面證實了RASSF1A啟動子甲基化狀態可能作為預后評價指標，并且早期吸煙可能是造成RASSF1A表觀遺傳改變的分子事件[10]。

表3 150例NSCLC預后多因素Cox回歸分析Tab 3 Survival outcome by multivariate Cox proportional hazard analysis in NSCLC (n=150)

在對RASSF1A的大量研究中發現，RASSF1A啟動子區甲基化狀態極有可能也與腫瘤預后相關。RASSF1A甲基化狀態作為腫瘤預后評價的指標在NSCLC中已有證實。Tomizawes等[11]在對110例I期肺腺癌患者的研究中發現，RASSF1A高甲基化與低生存率相關，并且與腫瘤的低分化程度及血管和胸膜的侵犯高度相關。Kim等[9]也發現RASSF1A啟動子高甲基化與I期、II期患者的預后均有關（P=0.02,P=0.01）。Endoh等[12]發現在I期和II期術后肺癌患者中RASSF1A高甲基化與肺癌術后早期復發相關（P=0.024 7）。但是也有1項對116例NSCLC的研究[13]發現，RASSF1A的甲基化狀態除了與腫瘤分化程度（P=0.024）和I期肺癌術后生存率（P=0.027 6）有關外，與腫瘤的臨床特征（TNM分期、腫瘤復發、淋巴轉移和是否吸煙）及II期和III期肺癌術后生存期均無關（P＞0.1）。進一步利用Cox回歸模型分析，結果除了腫瘤分期是腫瘤預后的危險因素外（P=0.008 9），其它因素包括RASSF1A甲基化狀態在內均與預后無關。因此RASSF1A甲基化并不能作為一個理想的肺癌預后評價指標。鑒于存在不同的研究結果，而國內尚未見RASSF1A異常甲基化在肺癌預后中的文獻報道，本實驗分析150例NSCLC術后5年生存資料和RASSF1A甲基化狀態，發現在I期、II期和IIIa期術后病人中，RASSF1A啟動子高甲基化的病例生存率低于未發生甲基化的病例，差異具有統計學意義（P=0.022,P=0.023,P=0.036）。IIIb-IV期的晚期NSCLC患者是否施行原發病灶切除需臨床謹慎判斷，本實驗中也選取了21例IIIb-IV期的原發病灶行手術切除的NSCLC作為研究對象，其中RASSF1A啟動子區高甲基化和未甲基化的病例生存期比較無統計學差異（P=0.118），考慮由于研究例數較少且晚期肺癌患者后期治療影響因素較多，結果還有待進一步研究。利用Cox模型進行多因素分析，將與NSCLC有關的因素（年齡、性別、組織類型、TNM分期、吸煙指數、開始吸煙年齡等）進行預后相關分析，發現除TNM分期外，RASSF1A啟動子區甲基化狀態也是影響NSCLC術后生存期的一個獨立因素（RR=1.584, 95%CI: 1.040-2.411,P=0.032），這一結果與Tomizawa[11]和Kim等[9]報道結果相同。

RASSF1A作為抑癌基因在抑制腫瘤發生中的作用越來越來受到研究者的關注。不斷有文獻報道，RASSF1A參與細胞周期調節[14-16]、誘導細胞凋亡[17]、穩定微管[18,19]等多種細胞生理功能。但其使RASSF1A啟動子區CpG島甲基化狀態發生變化、引起基因失活的原因尚未完全清楚。本實驗在較多人體肺癌組織標本中檢測RASSF1A啟動子甲基化狀態，分析與肺癌臨床特征及預后的關系，發現RASSF1A啟動子區甲基化狀態可以作為NSCLC術后的一個預后評價指標。