99Tcm-N(NOEt)2在KMB17人胚肺二倍體細(xì)胞與不同種類肺癌細(xì)胞中的攝取動力學(xué)比較

馬鐵昆 曹劍鳴 賈偉

18F-脫氧葡萄糖（fluorodeoxyglucose, FDG）PET/CT顯像對良、惡性腫瘤的鑒別診斷和臨床分期有獨(dú)特和重要的價(jià)值[1,2]，但其昂貴的儀器設(shè)備、藥物和檢查費(fèi)用均限制了它的臨床應(yīng)用和推廣[3,4]；而SPECT/CT也具有較高的檢測靈敏度、圖像分辨率和準(zhǔn)確定位，同時(shí)臨床檢查費(fèi)用低，普及率高，易于推廣和接受[5,6]，因此研究99Tcm（锝）等標(biāo)記的親腫瘤顯像劑是非常有必要的。

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，99Tcm-N(NOEt)2是一種非特異性親腫瘤陽性顯像劑，已被用于肺腫瘤等顯像的研究[7,8]，但肺炎性假瘤、肉芽腫、結(jié)節(jié)病、結(jié)核等良性病灶常導(dǎo)致假陽性，影響臨床肺癌診斷的準(zhǔn)確性，而這些良性病變內(nèi)常含有較多成纖維細(xì)胞。為此，本研究對多種肺癌細(xì)胞及肺癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞間99Tcm-N(NOEt)2攝取動力學(xué)進(jìn)行了比較研究，在細(xì)胞水平探討其用于肺腫瘤顯像的價(jià)值。

1 材料與方法

1.199Tcm-N(NOEt)2的制備與質(zhì)量控制 由99Mo-99Tcm發(fā)生器（中國原子能科學(xué)研究所原子高科股份有限公司）在（洗脫效率、淋洗間隔時(shí)間等）相似條件下新鮮淋洗的99TcmO4-，加入N(NOEt)2藥盒（北京師范大學(xué)師宏藥物中心），按說明書制備99Tcm-N(NOEt)2，放化純＞90%方可使用，稀釋至放射性濃度為3.7×107Bq/mL。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) YTMLC個(gè)舊人肺鱗癌細(xì)胞、SPC-A1人肺腺癌細(xì)胞、AGZY低轉(zhuǎn)移人肺腺癌細(xì)胞、973人高轉(zhuǎn)移肺腺癌細(xì)胞及GLC-82個(gè)舊人肺腺癌細(xì)胞由本院腫瘤研究所提供；KMB17人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)生物研究所（昆明）惠贈，所有細(xì)胞均由本院臨床實(shí)驗(yàn)中心培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%小牛血清的RPMI-1640（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），培養(yǎng)于37oC、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中。將對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶消化，吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)并及時(shí)使用。細(xì)胞懸浮于無血清的RPMI-1640中，細(xì)胞濃度為1×106/mL。實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)中用臺盼藍(lán)排除法檢測，細(xì)胞活力需＞85%。

1.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 塑料試管均先用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%小牛血清的PBS浸泡1 h，然后用PBS洗滌3遍以減少非特異性吸附。將50 μL（1.85 MBq）99Tcm-N(NOEt)2分別加入8 mL含8×106個(gè)細(xì)胞的KMB17人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞及各種肺癌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，振蕩混勻，迅速準(zhǔn)確取樣300 μL分別加入預(yù)處理好的塑料試管中，置于37oC恒溫培養(yǎng)，于5 min、15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min分別取出，600 rpm離心3 min，棄上清，用FH-408自動定標(biāo)儀（國營二六一廠）檢測放射性。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)非特異性吸附管，即空白實(shí)驗(yàn)（方法同上，只是不含細(xì)胞）；總計(jì)數(shù)管3個(gè)（不需離心）。

1.4 數(shù)據(jù)處理 攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果用攝取百分率表示：特異性細(xì)胞凈攝取放射性計(jì)數(shù)（沉淀放射性計(jì)數(shù)-空白放射性計(jì)數(shù)）/總放射性計(jì)數(shù)（300 μL細(xì)胞懸液放射性計(jì)數(shù)）。所有數(shù)據(jù)點(diǎn)取3個(gè)平行樣本，每個(gè)樣本重復(fù)測量3次。全部資料用Excel和SPSS錄入和統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布資料用Mean±SD表示；采用重復(fù)測量資料的方差分析（repeated measures analysis of variance）分析不同細(xì)胞的攝取率情況。多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較采用最小有意義差異t檢驗(yàn)（least significant difference-t test, LSD-t）檢驗(yàn)分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞系間攝取率差異比較 6種細(xì)胞（KMB17人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞和5種肺癌細(xì)胞）99Tcm-N(NOEt)2攝取率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F藥物=1 584.926，P＜0.001），其中，除SPC-A1細(xì)胞與973細(xì)胞攝取均數(shù)間多重比較的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（LSD-t檢驗(yàn)，P=0.838），其余兩兩之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。6種細(xì)胞的攝取率大小關(guān)系為：973與SPC-A1＞YTMLC＞GLC-82＞AGZY＞成纖維。

2.2 各測量時(shí)間點(diǎn)攝取率差異比較 各次重復(fù)測量間變化趨勢分析表明，7個(gè)測量時(shí)間的細(xì)胞攝取率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pillai's軌跡檢驗(yàn)F=5 016.575，P＜0.001）。除60 min與75 min、75 min與90 min之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（LSD-t檢驗(yàn)，P≥0.343），其余兩兩之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.006），即5 min、15 min、30 min、45 min、60 min的細(xì)胞攝取率逐漸升高，從60 min開始平緩，即60 min、75 min、90 min的細(xì)胞攝取率波動不大。

2.3 細(xì)胞種類與時(shí)間的交互作用 數(shù)據(jù)分析顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pillai's軌跡檢驗(yàn)F細(xì)胞×?xí)r間=3.863，P＜0.001），細(xì)胞種類與時(shí)間之間存在交互作用（表1）。

3 討論

99Tcm-N(NOEt)2是一種中性脂溶性心肌灌注顯像劑，De Beco等[9]報(bào)道99Tcm-N(NOEt)2在腫瘤細(xì)胞也有攝取，在細(xì)胞內(nèi)濃聚的機(jī)理尚不清楚。Johnson等[10]研究提示99Tcm-N(NOEt)2主要局限于細(xì)胞膜上或細(xì)胞膜內(nèi)。體外研究[11]表明，腫癌細(xì)胞攝取99Tcm-N(NOEt)2可能是簡單的彌散過程，不依賴溫度，其能被腫瘤細(xì)胞攝取且攝取率明顯高于99Tcm-MIBI [99Tcm-hexakis-2-methoxyisobutylisonitrile]，99锝m-六（2-甲氧基-2-異丁基異腈）]。其在肺腫瘤顯像的研究[7,8]顯示診斷準(zhǔn)確性達(dá)82.05%-85.00%， 但與99Tcm-MIBI和18F-FDG相似也可被肺的炎性假瘤、肉芽腫、結(jié)節(jié)病、結(jié)核等肺良性病變攝取，造成假陽性[7,8,12,13]，肺部呈陽性的良性病變組織中常存在大量的功能活躍的成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和血管增生、管腔的擴(kuò)張[14]。本研究中KMB17是一種人胚肺成纖維細(xì)胞，對KMB17成纖維細(xì)胞以及YTMLC個(gè)舊人肺鱗癌細(xì)胞、SPC-A1人肺腺癌細(xì)胞、AGZY低轉(zhuǎn)移人肺腺癌細(xì)胞、973人高轉(zhuǎn)移肺腺癌細(xì)胞及GLC-82個(gè)舊人肺腺癌細(xì)胞攝取99Tcm-N(NOEt)2的情況作對比研究，可以在一定程度上比較接近地反映肺炎性假瘤等肺良性病變和多種肺癌對99Tcm-N(NOEt)2攝取情況；同時(shí)，本研究中各種細(xì)胞的濃度均被調(diào)整為1×106/mL，振蕩混勻狀態(tài)每個(gè)樣本取量300 μL，相同體積的細(xì)胞懸液所含細(xì)胞數(shù)相同，而且各種培養(yǎng)液體積、蛋白含量、電解質(zhì)濃度以及99Tcm-N(NOEt)2放射性濃度、放化純及N(NOEt)2總含量也相同或比較相似，因此6種細(xì)胞的99Tcm-N(NOEt)2攝取動力學(xué)有可比性。

表1 99Tcm-N(NOEt)2在KMB17人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞和5種肺癌細(xì)胞中的攝取率Tab 1 The uptake rate of 99Tcm-N(NOEt)2 in KMB17 human embryonic lung diploid fibroblasts and five kinds of lung cancer cells

本研究結(jié)果顯示：各種細(xì)胞30 min-45 min時(shí)攝取率逐漸趨于平穩(wěn)，45 min攝取率均值約為攝取峰值均值的96.7%，提示臨床早期攝取觀察點(diǎn)應(yīng)在45 min左右。考慮體內(nèi)藥物不斷地被洗脫和代謝排出等因素的影響，早期顯像在30 min是適合的。99Tcm-N(NOEt)2在KMB17成纖維細(xì)胞和5種肺癌細(xì)胞攝取率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，大小關(guān)系為973與SPC-A1＞YTMLC＞GLC-82＞AGZY＞KMB17，KMB17在6種細(xì)胞中攝取率最低，因此，從本研究細(xì)胞攝取的層面顯示：99Tcm-N(NOEt)2顯像對肺腫瘤良、惡性的鑒別診斷是有應(yīng)用價(jià)值的；當(dāng)然，也注意到AGZY人肺腺癌細(xì)胞攝取峰值與KMB17成纖維細(xì)胞攝取峰值比值僅為1.082，這可能與本研究中的KMB17成纖維細(xì)胞處于對數(shù)生長期、功能較活躍有關(guān)；這也提示如果良性肺腫瘤中的成纖維細(xì)胞功能比較活躍，將可能導(dǎo)致診斷時(shí)出現(xiàn)假陽性或假陰性。臨床上肺內(nèi)異常活躍增生的病灶更容易發(fā)展為惡性病變，對這部分病變的檢出在一定程度上阻斷惡性轉(zhuǎn)歸，減少肺惡性腫瘤的發(fā)生。所以，99Tcm-N(NOEt)2顯像用于肺腫瘤良、惡性的鑒別診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究主要從離體細(xì)胞對99Tcm-N(NOEt)2的攝取動力學(xué)方面闡釋了肺癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的攝取差異，而體內(nèi)99Tcm-N(NOEt)2被腫瘤組織攝取和排出非常復(fù)雜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示細(xì)胞種類與時(shí)間有交互作用，細(xì)胞攝取率隨時(shí)間延長而增加，不同時(shí)間細(xì)胞攝取增加的程度并不相同，提示各種細(xì)胞對99Tcm-N(NOEt)2的攝取除了與細(xì)胞本身的功能有關(guān)外，可能還與99Tcm-N(NOEt)2在腫瘤細(xì)胞簡單彌散[11]程度、細(xì)胞膜Ca2+通道、P-糖蛋白表達(dá)等[8]影響攝取率的各種因素有關(guān)。因此對腫瘤的生長、代謝、血流灌注情況、瘤細(xì)胞的活力、增殖程度、P-gp腫瘤耐藥基因或蛋白的表達(dá)[8,9]以及良、惡性病變對顯像劑的洗脫差異等多種因素影響，尚需進(jìn)一步作臨床和實(shí)驗(yàn)研究。