姜黃素通過下調miR-186*促進人肺腺癌細胞A549/DDP 凋亡

唐妮 張艱 杜永平

據報道，吸煙導致肺癌的發病率逐漸增多，然而隨著鉑類作為一線抗癌藥物不斷應用于臨床，其耐藥已成為目前關注的熱點。發現一種既安全又有效的抗癌藥物并使其應用于臨床顯得非常重要。姜黃素是從姜黃科植物的根莖中提取的一種酚性化合物[1,2]，其各種藥理作用已有報道，包括抗炎、抗氧化及抗腫瘤等[3-5]。

microRNAs（miRNAs）是一組生物體基因組編碼的內源性非編碼小分子RNA，成熟的miRNA長度為19 nt-25 nt。miRNAs作為最初始的轉錄本經過RNase III Drosha和Dicer序列加工而被轉錄[6]。每個miRNA可調控許多mRNA，但是在機體組織中，miRNA的所有功能均為被系統地闡述[7]，研究[8]發現，在腫瘤的發展中，異常表達的miRNA起著非常重要的作用。有關腫瘤發展過程中基因變化的詳細知識或許對早期臨床診斷和治療措施的構建有很大幫助。miR-186*是一個在人肺腺癌耐藥細胞中新發現的基因，它在腫瘤細胞中的作用機制尚未見報道。本研究旨在闡明姜黃素是否可通過下調mir-186*的表達而抑制A549/DDP細胞生長的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 細胞系與培養 人肺腺癌細胞A549/DDP取自第三軍醫大學呼吸病研究所實驗室，細胞用RPMI-1640培養液加10%的胎牛血清和100 U/mL青霉素或100 μg/mL鏈霉素于37 °C、 5%CO2的孵箱中孵育。為了保持A549/DDP細胞耐藥的表型，每次換液時在細胞培養液中均添加順鉑（終濃度為1 μg/mL）。細胞用胰酶消化后計數。

1.2 miRNA芯片檢測 miRNA標記及miRNA點陣雜交實驗開始前，將不加順鉑的A549/DDP細胞培養1周后，消化并記數。總RNA的提取按照Invitrogen公司的RNA提取試劑盒說明進行。miRNA的進一步純化按照Ambion公司的mirVanaTMmiRNA 純化試劑盒進行。自A549/DDP細胞系中提取的RNA用Hy3標記。方法：按照Exiqon公司的miRCURYTMArray power標記試劑盒進行。RNA各自在miRCUPYTMLNA芯片上的雜交按照說明書進行（v 8.0, Exiqon）。微點陣圖像的掃描要求用GenePix 4000B掃描，數據的分析用GenePix Pro 6.0軟件及Excel表完成。以上實驗重復4次。

1.3 實時定量PCR分析從microarray芯片中篩選出的明顯表達的miRNA RNA的Trizol法提取用Invitrogen公司的RNA提取試劑盒進行，每個樣品重復3次，包括減去反轉錄的內參（U6），以便評估基因組DNA。用于實時定量PCR反應體系的試劑包括：2.0 μL 10×RT緩沖液（Ambion）、2.0 μL dNTPs、2.5 mM each （Ambion）、 1 μL 5×RT引物（如表1所示）、0.3 μL RNase抑制蛋白40 U/μL（Ambion）、2 μL wt-MMLV-RT、100 U/μL（Ambion），最終10 μL的液體里含有500 pg總RNA。實時定量PCR中總RNAs的提取與microarray分析中總RNAs來自同種樣品，然后，顯著表達的miRNAs和內參U6用ABI Prism 7600探測系統逆轉錄和擴增。樣品置于96孔板中，95 °C 、5 min，95 °C、10 s，60 °C、20 s，72 °C、20 s，分別進行40個循環。顯著表達的miRNA的定量數據分析采用2-△△Ct[9]法進行分析（表1）。

1.4 miRNA轉染 轉染試劑（DharmaFECT1）購買自Dharmacon。 mir-186*mimetics及mimetic controls（均為凍干寡聚核苷酸粉形式）由Dharmacon公司合成。miRNA mimetics是小的單股的miRNA寡聚核苷酸，模仿內源性的成熟miRNA。有活性的位點進入miRNA的作用途徑調控目標miRNA的表達。轉染效率的簡單估計由轉染入細胞Dharamcon公司的雙股siRNA熒光素酶，但未做功能方面的分析。

1.4.1 細胞培養 用于實驗的細胞消化后應被計數，在無抗生素的培養液中培養細胞。96孔板中，每孔培養液的體積是100 μL，細胞密度均勻適合，然后放置于37 °C、5% CO2的孵箱中過夜。

1.4.2 轉染 將miRNA mimetics和mimetic controls（5 nmol）分別溶解在RNase-free蒸餾水中。在1號管中溶解2 μM小干擾RNA，在2號管中加入轉染試劑，然后分別在以上兩管中加入無血清的培養液。再將兩管中的溶液上下顛倒混勻后，室溫放置5 min。最后將1號管中的液體吸出加到2號管中混勻后，再加入足夠的無抗生素的培養液，室溫放置20 min。之后，將原來的96孔板中的培養液棄掉，再將混合后的溶液以每孔100 μL的體積加到96孔板中。轉染后的細胞放置于37 °C、5% CO2的孵箱中孵育48 h。

1.5 凋亡的檢測

1.5.1 流式細胞儀法檢測細胞凋亡 凋亡的量用PI和Annexin V-FITC的雙重染色法測定。PI和Annexin V-FITC試劑盒購自B.D公司。姜黃素處理與轉染的細胞及其各自的對照組細胞用預冷PBS洗滌2次，再用5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI室溫孵育30 min，然后細胞用Becton-Dickinson FACS-420流式細胞儀分析。其發射的刺激波長分別是488 nm和525 nm。以上實驗重復3次。

表1 miR-186*和U6引物序列Tab 1 The primers of miR-186* and U6

1.5.2 MTT法檢測細胞存活率 15 μmol/L姜黃素處理和用0.02%DMSO作為對照處理A549/DDP細胞，24 h后，用預冷PBS洗滌2次后，分別依次加入MTT溶液20 μL，4 h后，吸取上清液，每孔加入150 mL DMSO，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的吸光度。轉染miR-186*mimetics和mimetic controls，48 h后，用預冷PBS洗滌2次后，分別依次加入MTT溶液20 μL，4 h后，吸取上清液，每孔加入150 mL DMSO，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的吸光度。以上實驗分別重復4次，存活率（survival rate）=處理組OD/對照組OD。

1.6 統計學方法 采用SPSS 11.0統計軟件進行處理，以MEAN±SD表示，組間比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素處理后miRNAs的表達水平變化 microarray實驗共獲兩張芯片，每個miRNAs的結果在芯片上重復4次，芯片的結果全做標準化處理。篩選差異表達較明顯的miRNAs：15 μmol/L姜黃素處理組與0.02%DMSO對照組比較后，上調或下調30%的miRNAs并且這些miRNAs的表達量在A549/DDP細胞中均超過0.2的才被選擇。其中6個miRNAs的表達顯著下調，6個miRNAs的表達顯著上調（P＜0.05）。在這些miRNAs中，mir-30b顯著上調56.5%，miR-186*顯著下調45.2%（圖1）。

圖1 與DMSO對照組相比，姜黃素處理后差異表達明顯的miRNAsFig 1 The significantly differentially expressed miRNAs after Curcumin treatment compared to DMSO controls

2.2 實時定量PCR驗證miR-186*的表達 microarray分析結果：與DMSO對照組相比，姜黃素處理后，miR-186*表達下調45.2%（n=3, P＜0.05）。實時定量PCR結果：姜黃素處理后，miR-186*的表達量為0.7±0.1，未處理組miR-186*的表達量為1.4±0.2。與DMSO對照組相比，姜黃素處理后，miR-186*的表達下調70.0%（n=3, P＜0.05）。實時定量PCR的實驗結果進一步驗證了microarray分析結果（圖2）。

2.3 流式細胞儀檢測由miR-186*調控的細胞凋亡 15 μmol/L姜黃素處理和用0.02%DMSO作為對照處理A549/DDP細胞，孵育24 h后收集細胞；轉染miR-186*mimetics和mimetic controls，孵育48 h后收集細胞。流式細胞儀法檢測細胞的凋亡圖（圖3A、圖3B）。圖3a表示姜黃素處理后與DMSO作為對照處理后細胞凋亡率。姜黃素處理后，細胞凋亡率為（8.6±0.9）%；DMSO作為對照處理后，細胞凋亡率為（3.0±0.4）%。與對照組相比，姜黃素處理后，細胞的凋亡率增加5.6%，姜黃素處理組與對照組比較有統計學意義（n=3, P＜0.05）；圖3b表示轉染miR-186*mimetics和mimetic controls后細胞凋亡率。轉染miR-186*mimetics后，細胞凋亡率為（1.5±0.4）%，轉染miR-186*mimetic controls后，細胞凋亡率為（3.1±1.0）%。與對照組相比，轉染miR-186*mimetics后，細胞凋亡率減少1.6%，miR-186*mimetics與mimetic controls比較有統計學意義（n=3, P＜0.05）。細胞凋亡率=Q2或Q2-1象限早期凋亡細胞的比率。

圖2 實時定量PCR檢測miR-186*表達Fig 2 The profile of miR-186* assayed by quantitative real-time PCR

圖3 流式細胞儀法檢測由miR-186*調控的細胞凋亡A： 姜黃素組、DMSO組的細胞凋亡圖；a： 姜黃素組、DMSO組的細胞凋亡。B：mimetics組、mimetic controls組的細胞凋亡圖；b： mimetics組、mimetic controls組的細胞凋亡。Fig 3 The apoptosis of miR-186* modulating detected by flow cytometry methodA: The cell apoptosis graph of curcumin group and DMSO group; a: The cell apoptosis rate of curcumin group and DMSO group.B: The cell apoptosis graph of mimetics group and mimetic controls group; b: The cell apoptosis rate of mimetics group and mimetic controls group.

圖4 MTT法檢測細胞存活率A：姜黃素組、對照組的細胞存活率；B：mimetics組、mimetics controls組的細胞存活率。Fig 4 The survival rates measured by MTT methodA: The cell survival rate of curcumin group and the control group; B: The cell survival rate of mimetics group and mimetics controls group.

2.4 MTT法檢測細胞存活率 15 μmol/L姜黃素處理和用0.02%DMSO作為對照處理A549/DDP細胞，24 h后，MTT法檢測細胞存活率：以未處理細胞存活率為100%作參照，標準化后，得出姜黃素處理后，細胞存活率為（55.6±5.1）%。與對照組相比，姜黃素處理后，細胞存活率下降了44.4%，姜黃素處理組與其對照組比較有統計學差異（n=4, P＜0.05）；轉染miR-186*mimetics和mimetic controls，48 h后，MTT法檢測細胞存活率：以轉染miR-186*mimetic controls后細胞存活率為100%作參照，標準化后，得出轉染miR-186*mimetics后，細胞存活率為（149.0±7.0）%。與對照組相比，轉染miR-186*mimetics后，細胞存活率增加了49.0%，miR-186*mimetics與mimetic controls比較有統計學差異（n=4, P＜0.05）（圖4A、圖4B）。

3 討論

姜黃素是從姜黃、郁金、菖蒲等中藥的根莖中提取的一種酚性化合物，具有降壓、抗心肌缺血、抗凝、降脂等多種作用，已有文獻[10]報道姜黃素對人胃癌細胞、結腸癌細胞等均具有明顯抑制細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡的作用。耐順鉑人肺腺癌A549/DDP細胞株是由親本人肺腺癌A549細胞株經DDP長期誘導形成的，已有文獻[11]報道姜黃素對A549/DDP細胞的增殖有抑制作用。

目前體內外的研究清楚地表明異常表達的miRNA與癌癥的發生有很大相關性。miRNA基因的表達僅占人類細胞有表達的所有基因的1%，但它被預測為可調控60%人類蛋白編碼基因的表達[12,13]，這就表明miRNA參與幾乎所有基因通路的重要作用[14]。除此以外，大量證據表明：人類癌癥的發生與miRNA的突變和異常表達密切相關，miRNA對人類癌癥的病理學和生理學的研究起著舉足輕重的作用[15]。掌握了這些知識，miRNA在腫瘤耐藥細胞表達量的變化，將為臨床對腫瘤的診斷和預后提供依據。換句話說，當研究聚焦在正常組織中miRNA與腫瘤耐藥細胞中miRNA表達量比較時，在估計臨床診斷和預后方面，更重要的是將miRNA的表達與腫瘤耐藥細胞的表型或臨床參數聯系起來，從而為臨床提供診斷和預后依據。

在腫瘤細胞中一些異常表達的miRNA可被清楚的分為致癌和抑癌基因。已有文獻報道姜黃素通過調控胰腺癌細胞中的miRNAs的表達，從而產生對腫瘤細胞的抑制作用，并能誘導腫瘤細胞的凋亡。胰腺癌中miR-23a、miR-22、miR-21的表達比正常組織降低，姜黃素可以上調它們的表達[19]；反之，miR-7、miR-199a*、miR-92在胰腺癌細胞中的表達被上調，姜黃素可以下調它們的表達[19]，其參與的信號通路例如：姜黃素通過上調miR-22的表達并下調其下游靶基因ESR1的表達而抑制胰腺癌細胞的增殖[19]。以上說明姜黃素可能通過調控miRNAs的表達而促使腫瘤細胞凋亡。而且，大量的實驗證據表明了姜黃素在腫瘤相關信號分子方面的可能的多種藥理作用的復雜機理[16-19]。但姜黃素通過調控miR-186*的表達而誘導A549/DDP細胞的凋亡的研究尚未見報道。

miR-186*是一個新發現的分子，位于染色體1p31.1，我們通過microarray分析技術發現其表達水平在姜黃素處理的A549/DDP細胞中被明顯下調，實時定量PCR驗證了microarray分析結果。流式細胞儀法分別檢測姜黃素處理后與DMSO作為對照處理后，A549/DDP細胞凋亡情況：與對照組相比，姜黃素處理后，細胞的凋亡增加5.6%；轉染miR-186*mimetics與mimetic controls后，與對照組相比，細胞的凋亡減少1.6%。MTT法檢測姜黃素處理后與DMSO作為對照處理后，細胞存活率情況：與對照組相比，姜黃素處理后，細胞存活率下降了44.4%；轉染miR-186*mimetics與mimetic controls后，與對照組相比，細胞存活率增加了49.0%。由此我們的得出姜黃素抑制腫瘤細胞增殖的機理如下：姜黃素通過下調miR-186*的表達而抑制肺腺癌細胞的增殖。

綜上，姜黃素抑制A549/DDP細胞的增殖和誘導細胞的凋亡可能是通過調控miR-186*而發揮作用的，然而所參與的信號通路還有待進一步研究。