實時熒光定量PCR 檢測人肺腺癌細胞Anip973、Anip973/NVB中hTERT mRNA的 表達

陳公琰 郭淑英 柳菁菁

肺癌是全世界常見的惡性腫瘤，是人類惡性腫瘤死亡的主要原因。由于三分之二的肺癌病人就診時已屬晚期，失去了手術機會，而化療是中晚期肺癌治療最重要的有效手段。然而化療過程中腫瘤細胞產生耐藥是化療失敗的主要原因之一，也是治療腫瘤的主要難題，如何克服腫瘤細胞多藥耐藥是目前臨床治療所面臨的巨大挑戰。端粒酶是一種細胞核糖核蛋白酶，端粒酶RNA片斷可作為模板將端粒DNA合成到染色體末端[1]。端粒酶與腫瘤細胞的增殖和永生化密切相關，端粒酶的激活可以使端粒長度不斷延長，從而使細胞無限增殖形成腫瘤。端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）為端粒酶的催化亞單位，是端粒酶活化的關鍵成分，與端粒酶活性密切相關。相關研究[2,3]表明端粒酶活性與細胞對化療藥物的敏感性密切相關，端粒酶活性高的病人化療效果差，說明端粒酶有可能參與了多藥耐藥機制。本研究采用實時熒光定量RT-PCR法檢測經長春瑞濱（Navelbine, NVB）處理前后人肺腺癌耐藥細胞Anip973/NVB與親代細胞Anip973的hTERT mRNA表達水平，探討端粒酶是否參與腫瘤的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人肺腺癌細胞株Anip973由黑龍江省腫瘤研究所惠贈，人肺腺癌耐藥細胞株Anip973/NVB由作者前期誘導建立[4]，NVB終濃度為2.0 μg/mL。細胞常規培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，于37oC、5%CO2的飽和濕度孵箱培養。每2天-3天傳代一次，每日觀察細胞形態，取對數生長細胞用于實驗。Anip973細胞和Anip973/NVB細胞均加入濃度為2.0 μg/mL的NVB，培養48 h后進行實驗。

1.2 藥物與試劑 NVB購自法國皮爾·法伯藥物研制公司；二甲基四氮唑藍（MTT）購自Sigma；順鉑（CDDP）購自科鼎醫療有限公司；表阿霉素（EPI）購自浙江海工藥業股份有限公司；健擇（GEM）購自禮來公司；伊立替康（CPT-11）購自輝瑞公司；足葉乙甙（VP-16）麗珠集團利民制藥廠；RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；RT-PCR試劑盒購自廣州達暉生物技術有限公司；引物、Taqman探針由廣州達暉生物技術有限公司合成。

1.3 MTT法測定細胞抗藥性 取對數生長期的Anip973細胞和Anip973/NVB細胞，以1×104/mL的濃度接種于96孔培養板，每孔180 μL，37oC、5%CO2條件下培養4 h，分組加藥，每個濃度設3個平行孔，處理組加入培養液稀釋的不同濃度的各種化療藥物（長春瑞濱、順鉑、表阿霉素、健擇、依立替康、足葉乙甙）各20 μL，陰性對照組加生理鹽水，培養48 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液，繼續培養4 h后，甩板去除培養液后每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩至沉淀完全溶解，在全自動酶標儀上選擇波長490 nm測定吸光值（A值），根據A值計算各藥物的半數抑制率（IC50）。根據各組細胞IC50與敏感細胞IC50的比值計算耐藥指數（resistance index, RI）。實驗重復3次，取平均值。

1.4 引物與探針 引物、Taqman探針由廣州達暉生物技術有限公司合成，見表1。

1.5 細胞總RNA提取 采用UNIQ-10柱總RNA提取試劑盒提取RNA，實驗步驟按說明書進行。使用紫外分光光度儀來檢測提取總RNA的含量及純度。要求A260/A280的比值均在1.8-2.0之間，說明RNA純度較高，未被蛋白質、酚污染，完全可以滿足RT-PCR需要。

1.6 cDNA的合成 反應體系20 μL。包括5×逆轉錄buffer [50 mmol Tris-HCl（pH8.0）, 50 mmol KCl, 4 mmol MgCl2, 10 mmol DTT] 4 μL，上游外引物（10 pmol/μL）0.4 μL，下游外引物（10 pmol/μL）0.4μL，dNTPs（10 mmol/μL）0.2 μL，MMLV（200 U/μL）1 μL，DEPC水9 μL，RNA模板5 μL。反應條件為37oC、60 min，95oC、3 min。

1.7 熒光定量PCR反應 反應體系50 μL。包括5×PCR buffer[10 mmol Tris-HCl（pH8.0）, KCl 50 mmol, MgCl22 mmol]10 μL，上游內引物F（10 pmol/μL）1 μL，下游內引物R（10 pmol/μL）1 μL，dNTPs（10 mmol）1 μL，cDNA產物5 μL，ddH2O 32 μL。反應條件為93oC、2 min，93oC、45 s，55oC、1 min，共40個循環。

1.8 標準曲線的繪制 標準品質粒的構建由廣州達暉生物技術有限公司完成，作為制備標準曲線的模板，與待測樣品同時進行PCR擴增，繪制標準曲線。用2-ΔΔCt法計算各個樣品的hTERT表達量，其中ΔCt =檢測樣品Ct值-內參Ct值；ΔΔCt=陽性待測組樣品ΔCt-正常樣品組ΔCt。

1.9 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件對實驗數據進行統計學分析，兩兩比較用t檢驗，以P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 耐藥譜分析 MTT法檢測耐藥細胞與親代細胞對各種抗癌藥的細胞毒作用，結果表明Anip973/NVB對NVB的耐藥指數為27.43，并對伊立替康、順鉑、足葉乙甙、表阿霉素等未接觸過的抗腫瘤機制不同的抗癌藥物也產生交叉耐藥（P＜0.05），見表2，表明其耐藥性穩定。

2.2 總RNA的OD值及濃度 RNA樣品A260/A280的比值均在1.8-2.0之間，說明RNA純度較高，未被蛋白質、酚污染，完全可以滿足RT-PCR需要。RNA的濃度：Anip973細胞為1.008 μg/μL，Anip973/NVB細胞為0.912 μg/μL。

圖1 不同模板濃度下hTERT實時PCR熒光曲線Fig 1 Real-time flourescence curves of hTERT in different template quantity From left to right the concentrations of templates are: 1×105, 1×106, 1×107, 1×108.

圖2 hTERT的實時PCR標準曲線Fig 2 Standard real-time PCR curve of hTERT

圖3 Anip973/NVB和Anip973細胞hTERT的實時PCR熒光曲線Fig 3 Real-time PCR flourescence curves of Anip973/NVB and Anip973 1, 2, 3: Anip973 cell; 4, 5, 6: Anip973/NVB cell.

2.3 hTERT mRNA標準品熒光曲線與標準曲線 圖1為梯度稀釋的hTERT mRNA標準品的動態擴增曲線，根據動態擴增曲線建立標準曲線，以模板稀釋倍數的對數值為橫坐標，循環閾值（cyle threshold, Ct）值為縱坐標，表明在1×105-1×108范圍內以10倍梯度稀釋這樣一個大的跨度范圍內，DNA的拷貝數與Ct之間存在良好的線性關系，統計學分析相關系數R2＞0.99，線性關系極好。圖2顯示不同起始濃度模板進入PCR指數增長期的起始點即不同，拷貝數越大Ct值越小。不同濃度的模板進入PCR平臺期后，PCR產物差異也比較大且不成比例。不同濃度標準品的Ct值與該標準品濃度的對數存在線性關系，起始濃度越高，Ct值就越小。

表1 引物和Taqman探針序列Tab 1 The sequences of primers and Taqman probes

表2 Anip973和Anip973/NVB細胞藥物敏感性對比Tab 2 The contrast of drug sensitivity between Anip973 and Anip973/NVB cell

表3 Anip973和Anip973/NVB細胞hTERT mRNA的表達Tab 3 Expression of hTERT mRNA in Anip973 and Anip973/NVB cell

2.4 NVB對Anip973和Anip973/NVB細胞hTERT mRNA表達的影響 2.0 μg/mL NVB處理前后親代細胞與耐藥細胞的hTERT mRNA表達見表2，反應后的熒光曲線見圖3。對照組Anip973和Anip973/NVB細胞hTERT mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05）；NVB處理組Anip973細胞hTERT mRNA表達顯著降低，與對照組Anip973細胞比較有統計學差異（P＜0.01）；NVB處理組Anip973/NVB細胞hTERT mRNA表達亦有降低，但與對照組Anip973/NVB細胞比較差異無統計學意義（P＞0.05）；在NVB處理組，Anip973細胞hTERT mRNA表達的降低程度明顯高于Anip973/NVB細胞 （P＜0.01），有統計學差異（表3）。

3 討論

腫瘤細胞的多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）是導致腫瘤化療失敗的主要原因之一。端粒酶是一種核糖核蛋白復合物，hTERT是端粒酶活性調控的限速因子，hTERT基因的表達與端粒酶活性表達一致。在腫瘤發生過程中，端粒酶的再激活可能參與細胞癌變過程。有研究[2,5]表明抑制端粒酶活性可提高細胞對化療藥物的敏感性，化療藥物也可降低腫瘤細胞的端粒酶活性，hTERT mRNA可能與MDR1、MRP-mRNA及C-myc相關[6]，提示端粒酶可能參與了腫瘤細胞的耐藥機制。

本實驗以人肺腺癌Anip973、Anip973/NVB細胞為研究對象。Anip973/NVB細胞是通過逐漸增加劑量法誘導而成，是穩定的肺癌獲得性多藥耐藥細胞系[4]，用MTT法進行耐藥譜分析，Anip973、Anip973/NVB細胞48 h的IC50值分別為0.38 μg/mL、10.38 μg/mL，RI為27.43，對伊立替康等四種藥物也產生了交叉耐藥，說明其耐藥性穩定。用實時熒光定量RT-PCR法檢測了Anip973、Anip973/NVB細胞hTERT mRNA的表達情況，在模板稀釋1 000倍時，hTERT標準品表現為陽性擴增，呈明顯的S型，其靈敏度達到了極限，可以檢測到微量的基因，這是傳統的PCR難以做到的，說明實時PCR技術有較高的靈敏度。本研究結果表明Anip973、Anip973/NVB細胞均有端粒酶hTERT mRNA表達，對照組親代細胞和耐藥細胞的hTERT mRNA表達無統計學差異（P＞0.05），NVB處理組Anip973細胞hTERT mRNA表達明顯降低（P＜0.01），而Anip973/NVB細胞hTERT mRNA表達雖有下調趨勢，但與對照組耐藥細胞比較差異無統計學意義（P＞0.05），同時NVB處理組Anip973/NVB細胞hTERT mRNA表達明顯高于Anip973細胞（P＜0.01），差異有統計學意義，說明在化療藥物長期刺激下，端粒酶的表達活性更加穩定且能保持持續活化，細胞自身修復能力明顯增強，使得耐藥細胞對化療藥物具有更加良好的抵抗性和適應性。由此可見，端粒酶與腫瘤細胞多藥耐藥具有一定的相關性，這與相關文獻報道相似[7,8]。

端粒酶在維持長度、保持染色體穩定性方面有重要作用，在絕大多數腫瘤細胞中都有端粒酶高表達，正常細胞中端粒酶不表達或低表達。在正常組織和腫瘤組織中端粒酶表達、端粒長度和細胞動力學的差別顯示出以端粒酶作為治療靶點會相對安全，抑制端粒酶能有效提高耐藥細胞對化療藥物的敏感性[9]，針對端粒酶的反義治療有利于逆轉腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性[10,11]，提示端粒酶抑制劑可治療腫瘤并有可能逆轉腫瘤細胞耐藥。本實驗利用實時熒光定量RT-PCR法檢測hTERT mRNA表達，證實端粒酶可能參與了人肺腺癌Anip973/NVB細胞的MDR，提示可將端粒酶作為逆轉耐藥的新靶點，至于如何利用端粒酶抑制劑逆轉耐藥及如何將其應用于臨床仍需在今后的研究中進一步探索。