白藜蘆醇抑制EGF誘導人肺腺癌A549細胞侵襲

黃寧宇 蘆宏 常麗君 張紅偉 張灝 李冠武

肺腺癌是世界上發病率和死亡率都很高的癌癥，這主要是由于其具有極強的轉移侵襲能力。而轉移侵襲的第一步就是分泌基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs），降解細胞外基質[1,2]。因此抑制其分泌MMPs是治療腫瘤的靶點。

白藜蘆醇（Resveratrol, RSV）是一種由植物合成的對抗外來病原的多酚類化合物，已在多種植物中被發現。早前研究[3]顯示白藜蘆醇有很好的抗腫瘤生物學活性和藥理作用，例如可抑制人肺癌、白血病、食管癌、乳腺癌等細胞的生長。雖已有人報道過白藜蘆醇對A549細胞的生長抑制作用，但尚未見有關白藜蘆醇抑制肺腺癌侵襲的完整報道。因此，本實驗以A549細胞為材料，對白藜蘆醇抑制其侵襲的作用及機制進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 白藜蘆醇（Sigma公司，純度99%）用DMSO（二甲基亞砜）溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌，貯存液濃度為500 mmol/L，-20oC避光保存。DMEM培養基、噻唑藍（MTT）均購自Sigma公司，胎牛血清為美國Hyclone公司產品，Transwell和Matrigel購自BD公司，明膠購自上海生工生物工程技術服務有限公司，ERK2兔抗人多克隆抗體購自Cell Signaling，PI3K(p85α)兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司，p-ERK1/2兔抗人多克隆抗體購自Bioworld，鼠抗人β-actin抗體購自Sigma公司，其它試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養 A549細胞常規培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養基中，置37oC、飽和濕度、5%CO2的培養箱中培養，2天傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 MTT法測定白藜蘆醇對A549細胞的毒性作用 將A549細胞濃度調整為1×105個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。實驗組加入白藜蘆醇（0, 10 μmol/L, 20 μmol/L, 30 μmol/L, 40 μmol/L, 50 μmol/L, 75 μmol/L, 100 μmol/L），每組設6個平行孔， 同時設DMSO對照組（加入培養液和0.1%DMSO），置培養箱培養24 h后每孔加入MTT（5 mg/mL）10 μL，繼續培養4 h后，然后每孔加入150 μL DMSO，室溫避光震蕩15 min，酶聯免疫檢測儀檢測492 nm波長OD值，結果取6個復孔的均值。計算不同濃度白藜蘆醇對細胞生長的抑制率，從而確定其對A549細胞無明顯殺傷的濃度范圍（細胞活性抑制率大約小于80%）。

1.4 侵襲檢測 用培養基將Matrigel稀釋為200 μg/mL涂到Transwell的上表面，把A549細胞濃度調整到1×106個/mL，加300 μL到Transwell上室，置培養箱4 h待細胞貼壁后，加藥如下：①control，②10 ng/mL EGF，③10 ng/mL EGF+10 μM RSV，④10 ng/mL EGF+20 μM RSV（以上均用無血清DMEM配制），Tranwell下室均加上含1%FBS的DMEM。然后置細胞培養箱培養24 h，取出，去掉培養基，以棉簽拭去小室濾膜上表面的細胞，用PBS洗后，將小室置于95%乙醇中固定10 min后再用PBS洗5 min兩次，蘇木素染色2 min-5 min，水洗后倒置于200倍普通顯微鏡下隨機計數5個視野內的膜下面的細胞數。

1.5 明膠酶譜法檢測不同濃度的白藜蘆醇對EGF誘導A549分泌MMP-2的抑制效果 先對A549細胞如下處理：①control，②10 ng/mL EGF，③10 ng/mL EGF+10 μM RSV，④10 ng/mL EGF+20 μM RSV（以上均用無血清DMEM配制），放入培養箱培養24 h后，吸取培養基，用10 kd孔徑的超濾離心管離心（6 000 rpm），每碟培養皿的培養基由3 mL濃縮為150 μL，取25 μL樣品與相同體積的2×非還原型樣品緩沖液在含有1 mg/mL明膠的10%丙烯酰胺凝膠4oC下電泳2.5 h，洗脫液（2.5%Triton X-100）室溫下洗脫兩次，每次30 min，再用超純水漂洗4次，每次10 min，之后在孵化液（50 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L CaCl2, pH 7.6）孵化48 h，接著在染色液（0.05%考馬斯亮藍R-250，30%甲醇，10%乙酸）染色2 h，最后用脫色液（20%甲醇，10%乙酸，70%超純水）脫色，得到結果掃描儲存，以Bio-Rad Quantity One分析。

1.6 Western blot檢測ERK和PI3K-Akt通路相關蛋白的表達變化 收集分別受10 ng EGF、10 ng EGF+20 μM RSV作用不同時間段（0.5 h, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h）的細胞和對照組細胞。加入適量含PMSF、釩酸鈉的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min；4oC下10 000 rpm/min離心15 min；取上清，即為細胞全蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉至NC膜上。10%牛奶封閉非特異抗原，加入一抗[兔抗人p-ERK1/2，ERK2，PI3K(p85α)多克隆抗體，鼠抗人β-actin抗體]4oC反應過夜，常溫洗膜后加入二抗，室溫反應1 h。用Pierce公司的Supersignal West Dura Extended Duration Substrate ECL化學發光系統進行檢測，將A液與B液等體積混合，配成發光劑，滴在保鮮膜上，將NC膜倒扣于其上，5 min后用另一保鮮膜將NC膜包裹，X線片壓片，曝光20 s-5 min，顯影2 min，定影2 min。Western blot結果掃描儲存，以Bio-Rad Quantity One分析。

1.7 統計學分析 各組實驗獨立重復3次，實驗數據用SPSS 13.0統計軟件進行處理，實驗組與對照組及誘導組的組間差異比較采用t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對A549細胞活力的影響 MTT實驗結果顯示：A549細胞在0 μM-30 μM白藜蘆醇作用24 h后活力無明顯變化，這表明該濃度范圍的白藜蘆醇對A549細胞無毒性。而在40 μM-100 μM白藜蘆醇對A549細胞活力有劑量依賴性的抑制作用（圖1）。

2.2 Transwell小室法檢測白藜蘆醇對EGF誘導A549細胞侵襲的抑制 EGF促進A549細胞侵襲，其侵襲能力增強了

22.9 %，20 μM白藜蘆醇則明顯地抑制其誘導細胞侵襲，與E10組相比，其抑制率達到36.4%。而10 μM白藜蘆醇對EGF誘導A549細胞侵襲的抑制作用并不明顯（圖2）。

圖1 MTT法檢測不同濃度白藜蘆醇作用24 h對A549細胞活力的影響柱狀分析圖顯示白藜蘆醇在30 μM內對A549細胞沒有明顯毒性。*：與對照組相比，P＜0.05。Fig 1 A549 cell viability after treatment with Resveratrol at various concentrations for 24 h dectected by MTTThe result reveals that Resveratrol was not toxic to A549 cells at a concentration between 0 to 30 μM.*: compared with the control, P＜0.05.

圖2 10 μM 和20 μM白藜蘆醇對EGF誘導A549細胞侵襲的抑制作用A：在200倍倒置顯微鏡拍攝各組侵襲穿透Matrigel的A549細胞照片；B：細胞侵襲結果柱狀分析圖，結果顯示20 μM白藜蘆醇可有效地抑制EGF誘導的A549細胞侵襲。*: 與對照組相比，P＜0.05；#: 與E10組相比，P＜0.05。Fig 2 Effects of 10 μM and 20 μM Resveratrol on EGF-induced A549 cells invasion A: Photos of the A549 cells having penetrated the Matrigel (taken under a microscope with 200-fold ); B: The analysis of A549 cells invasion. It shows that 20 μM Resveratrol inhibited A549 cells’ invasion effectively.*: compared with the control, P＜0.05; #: compared with E10 group, P＜0.05.

圖3 10 μM 和20 μM的白藜蘆醇對EGF誘導A549分泌MMP-2的抑制作用A：明膠酶譜法檢測MMP-2活性；B：柱狀分析圖表明20 μM 白藜蘆醇有效地抑制EGF誘導的A549細胞中MMP-2的活性。*：與對照組相比，P＜0.05；#：與E10組相比，P＜0.05。Fig 3 Inhibitory effects of 10 μM and 20 μM Resveratrol on the MMP-2 activity of A549 cells stimulated by EGFA: The activity of MMP-2 determined by gelatine zymography; B: The densitometric analysis reveals that the activity of MMP-2 of EGF-induced A549 cells was inhibited significantly by 20 μM Resveratrol.*: compared with the control, P＜0.05; #: compared with E10 group, P＜0.05.

圖4 20 μM白藜蘆醇對p-ERK1/2和PI3K(p85α)的抑制作用A：EGF和EGF+RSV作用不同時間段（0.5 h，1 h，2 h，3 h和6 h）后，A549細胞內p-ERK1/2和PI3K(p85α)的Western blot檢測結果，以β-actin和ERK2作為內參；B和C：p-ERK1/2和PI3K(p85α)含量變化的柱狀分析圖；結果顯示20 μM白藜蘆醇在多個時間段內抑制p-ERK1/2和PI3K(p85α)。*：與對照組相比，P＜0.05；#：與同時段E10組相比，P＜0.05。Fig 4 Inhibitory effects of 20 μM Rresveratrol on p-ERK1/2 and PI3K(p85α)A: The expressions of p-ERK1/2 and PI3K(p85α) detected by Western blot,the A549 cells were treated respectively with 10 ng EGF and 10 ng EGF +20 μM RSV for various periods of time (0.5，1，2，3 and 6 h) , β-actin and ERK2 served as internal control; B & C: The densitometric analysis of p-ERK1/2 and PI3K(p85α) shows that 20 μM Resveratrol suppressed p-ERK1/2 and PI3K(p85α) in several periods of time.*: compared with the control, P＜0.05; #: compared with the E10 group of the same time period, P＜0.05.

2.3 明膠酶譜法檢測白藜蘆醇抑制EGF誘導A549細胞分泌MMP-2 EGF 促進A549細胞分泌MMP-2，其分泌量比對照組增加了38.6%，10 μM和20 μM白藜蘆醇對EGF誘導A549分泌MMP-2均有抑制作用，其中20 μM白藜蘆醇效果明顯，與E10組相比，其抑制率達到49.3%（圖3）。2.4 20 μM白藜蘆醇在不同時間段對p-ERK1/2和PI3K的抑制 EGF均促進了A549細胞中ERK1/2和PI3K的活性，其中對ERK1/2更為顯著，特別是在2 h時段，ERR1/2磷酸化程度最高。對比同時段的EGF誘導組，在1 h、2 h、3 h、6 h中，20 μM白藜蘆醇在每個時間段中都抑制ERK1/2的磷酸化，類似地，從1 h開始的各個時間段，20 μM白藜蘆醇處理組與同時段的EGF誘導組相比，PI3K含量明顯下降。（圖4）。

3 討論

白藜蘆醇是一種純天然小分子化合物，生物作用廣泛，近年來其抗癌作用一直受到全世界研究學者的廣泛關注。研究集中在白藜蘆醇對腫瘤的起始、增殖、發生、轉移各個階段的抑制和誘導腫瘤細胞凋亡，并已發現其對多種腫瘤作用明顯。另一方面，白藜蘆醇毒副作用小，是一種比較理想抗腫瘤物質。我們通過MTT檢測發現白藜蘆醇在30 μM之內對A549細胞沒有明顯的細胞毒性，據此確定用該濃度范圍的白藜蘆醇對A549細胞的侵襲抑制進行檢測。

EGF是一種重要的細胞因子，對細胞的增殖、黏附、轉移等起著促進作用。經過多次試驗摸索，我們確定10 ng/mL的EGF能明顯增強A549細胞侵襲和轉移，因此以其作為實驗的誘導劑。

惡性腫瘤侵襲周圍組織分為三個獨立步驟：對細胞外基質（extracellular matrix, ECM）的降解、細胞侵襲轉移、細胞增殖[4]。MMPs的過度分泌在侵襲的過程中起著關鍵的作用，腫瘤細胞通過其對細胞外基質進行降解，突破周圍組織的限制。之前的文獻大多只關注藥物對A549過度分泌MMP-2抑制，而不是MMP-9。此外，也有文獻[5]報道MMP-2和MMP-9在非小細胞肺癌中均會對基底膜有破壞作用，我們經過多次實驗發現A549細胞主要分泌MMP-2，而MMP-9相對很少，同時白藜蘆醇也只對MMP-2起抑制作用，而對MMP-9沒有明顯的抑制（未發表資料），因此我們在本研究中只關注MMP-2的變化。那么白藜蘆醇為什么只抑制MMP-2，而不抑制MMP-9？有關的研究正在進行，如發現有意義的結果將另文發表。計算EGF誘導組和白藜蘆醇處理組中A549細胞侵襲穿透涂有Matrigel小濾膜的細胞數目（Transwell小室法），可以得出，EGF促進了細胞侵襲，而白藜蘆醇抑制了這種誘導的侵襲，20 μM白藜蘆醇抑制侵襲的效果明顯，比EGF誘導組減少36.4%。明膠酶譜法檢測發現20 μM白藜蘆醇可有效地減少EGF誘導A549分泌MMP-2，比誘導組MMP-2的分泌量減少了49.3%，從而降低了分解、穿透Matrigel的能力，這進一步證實了之前Transwell侵襲實驗的結果。

EGF對腫瘤細胞侵襲的促進作用一般認為主要通過ERK通路或PI3K-Akt通路[6-10]。這兩條信號通路與腫瘤細胞生長、運動、粘附和基質金屬蛋白酶分泌與降解等轉移因素密切相關。其機制可能是：EGF與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）結合，EGFR發生二聚化和自身磷酸化，為帶有SH2或PTB結構域的胞內信號蛋白分子如Shc、Grb-2、Gab1等提供結合位點。Shc和Grb2聚集到酪氨酸磷酸化的受體上后，鳥苷酸交換因子Sos結合Grb2，活化Ras蛋白，接著通過Ras-Raf-MEK途徑將ERK1/2磷酸化為p-ERK1/2，活化的p-ERK1/2后進入核內作用轉錄因子c-Fos和c-Jun，上調MMP基因的表達[6,11-14]。同時，結合到EGFR的Gab1也被活化，其C-端特定酪氨酸磷酸化后成為PI3K的調節亞基p85的結合位點，招募大量的PI3K，在EGF的刺激下PI3K催化PIP2磷酸化形成第二信使PIP3，PIP3促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308導致Akt的活化?；罨腁kt能提高腫瘤細胞的運動能力、降低細胞間的粘附力、增加核轉錄因子NF-κB通的活性和MMP的分泌，從而促進細胞侵襲[6,10,15]。

因此，對ERK通路和PI3K-Akt通路的抑制或者阻斷是降低A549細胞侵襲的重要途徑。本研究初步探究白藜蘆醇抑制EGF誘導的A549細胞侵襲的機制，即用Western blot檢測白藜蘆醇對A549細胞中ERK1/2和PI3K活化的抑制效果。

Western blot實驗結果表明：EGF誘導A549細胞內的ERK1/2磷酸化在短時間內達到很高水平（0.5 h-2 h），之后降低，20 μM白藜蘆醇能在各個時間段明顯地抑制ERK1/2的磷酸化，尤其是在2 h時間段抑制最為明顯，同時檢測了ERK2總量，發現基本未發生變化，說明白藜蘆醇確實可抑制p-ERK的表達即ERK1/2的磷酸化。同樣，白藜蘆醇也在大多數時間段中抑制了PI3K，說明白藜蘆醇對ERK通路和PI3K-Akt通路均起到了抑制作用。

綜合本實驗研究結果，我們可以得出：20 μM白藜蘆醇能夠有效地抑制EGF誘導的A549細胞的侵襲，其機制可能是通過抑制EGFR通路中ERK1/2的磷酸化和PI3K活性，從而降低A549細胞分泌MMP-2，最終抑制其細胞侵襲。