紫杉醇通過上調TAP-1, TAP-2以及消除調節性T細胞逆轉肺癌免疫逃逸

鐘華 韓寶惠

化學療法作為肺癌常規治療的中堅力量，其目的是最大限度的殺傷腫瘤，但由于化療藥物對機體免疫系統有一定程度的殺傷或抑制效應，因而普遍認為化療抑制了機體的免疫功能。但是新近的研究發現，某些化療藥物可以通過增強腫瘤細胞免疫原性，促進腫瘤細胞釋放諸如熱休克蛋白，鈣結合蛋白等內源性危險信號，以及抑制調節性T細胞（regulatory T cells, Treg）等機制介導抗腫瘤免疫，對機體的免疫系統有獨特的貢獻[1,2]；本文研究抗微管的化療藥物—紫杉醇對小鼠肺部腫瘤治療過程中獨特的增強免疫原性的機制；在已有的研究[3]中，發現紫杉醇5×10-8mol/L的濃度刺激抗原遞呈細胞的功能成熟；在本研究中，進一步應用此濃度的紫杉醇探討其對腫瘤細胞抗原肽轉運體（transporters associated with antigen processing, TAP）的表達影響和對調節性T細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI-1640，小牛血清為美國Gibco公司產品；重組鼠源性GM-CSF、IL-4為Peprotech公司產品；抗鼠FITC-CD11b、PE-CD11b、APC-B220、FITC-CD4、PEFoxP3由Biolegend公司提供；流式一抗：FITC-MB1、FITC-Deta、FITC-Calreticulin、FITC-TAP1、FITC-TAP2、FITC-β2microglobulin由Biotechnologies公司提供；流式二抗由DAKO公司提供；小鼠Lewis肺癌細胞株（3LL）為中科院細胞研究所提供；雄性C57BL/6小鼠由上海市腫瘤研究所提供；紫杉醇由美國施貴寶公司提供。

1.2 檢測腫瘤細胞表面TAP-1和TAP-2表達 細胞培養分兩組，一組為3LL 細胞培養于RPMI-1640完全培養中，置于37oC、5%CO2培養箱中；5 d后消化貼壁的腫瘤細胞；另一組細胞在5 d貼壁生長后，加入終濃度為5×10-8mol/L的紫杉醇；48 h后收集細胞；兩組細胞分別分成細胞懸液7管，每管含單細胞懸液2×106個-5×106個，用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗滌兩次，含2%多聚甲醛的PBS室溫下固定20 min，洗滌后，懸浮于含0.5%的PBS液，轉移至玻璃小管中，微波處理（200瓦）直至液體沸騰，立即轉入冰上冷凍，含1%BSA的PBS洗滌一次；將含1%BSA和0.1%皂角苷的PBS滲透樣品30 min，分別加入同型對照，流式一抗： FITC-TAP1、FITC-TAP2；室溫下30 min；含1%BSA和0.1%皂角苷的PBS洗滌兩次，加入羊抗鼠的流式二抗，室溫下30 min；含1%BSA和0.1%皂角苷的PBS洗滌兩次后，含1%BSA的PBS再洗滌一次，0.5%多聚甲醛固定，檢測；本實驗重復3次。

1.3 小鼠尾靜脈接種腫瘤細胞 3LL腫瘤細胞0.3×106個，懸浮于500 μL PBS液中，從小鼠尾靜脈中注入；接種后隨機將小鼠分入腫瘤組和化療組；設立空白對照組。

1.4 化療藥物的注射 3LL腫瘤細胞小鼠尾靜脈接種后8 d，化療組小鼠腹腔內接種紫杉醇，0.012 5 mg/只，懸浮于500 μL PBS溶液中；腫瘤組小鼠腹腔內注射500 μL PBS溶液；21 d后取化療組，腫瘤組，空白對照組小鼠的肺部組織；本組實驗重復3次。

1.5 小鼠肺部組織單細胞懸液的獲得 將DNA酶、膠原酶和透明質酸酶混合，取4.5 mL上述的混合酶。取出肺部組織，眼科手術剪將小鼠肺部剪碎，置于混合酶中，37oC、5%CO2培養箱中孵育20 min取出。研磨，應用孔徑為75 μmol/L的細胞過濾器過濾獲得小鼠的肺部組織單細胞懸液；將細胞懸液的濃度調整為1×106/mL。

1.6 Treg細胞的流式分析 上述的細胞懸液用FACS緩沖液洗滌，洗滌后加入FoxP3固定液，室溫下避光孵育20 min，染色緩沖液洗滌后再用FoxP3緩沖液洗滌一次，懸浮細胞于FoxP3緩沖液中，室溫避光15 min，洗滌后，分成5管，每管細胞為1×106個，分別加入同型對照，FITC-CD11b、PE-CD11b、APC-B220、APC-B220+FITCCD4+PE-FoxP3各20 μL， 室溫避光30 min，染色緩沖液洗滌2次，上機分析；數據檢測應用winMDI 2.8軟件分析；二維點陣圖勾勒CD25、CD4雙陽性細胞，在其中確認FoxP3的細胞，即為Treg細胞的比例；

1.7 統計學分析 采用SPSS 10.0軟件分析，配對t檢驗和方差分析；所測數據用Mean±SD表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤細胞表面TAP表達的檢測結果 經紫杉醇5×10-8mol/L處理的3LL細胞表面TAP1的表達（5.68%±0.65%）顯著高于3LL細胞組（1.93%±0.25%），差異具有統計學意義（P=0.006）。經紫杉醇5×10-8mol/L處理的3LL細胞表面TAP2的表達（89.54%±4.8%）顯著高于3LL細胞組（67.78%±5.08%），差異具有統計學意義（P=0.036）（表1）。

2.2 流式分析定義Treg細胞 典型的流式分析Treg細胞見圖1；根據前向散射儀（FSC）和側向散射儀（SSC）的參數勾勒所需分析的細胞，定義為R1（圖1A）；在R1細胞群中勾勒CD25和CD4雙陽性的細胞，定義為R2（圖1B）；在R2細胞群中分析陽性表達FoxP3的細胞，即為Treg細胞（圖1C）。

2.3 肺部腫瘤局部Treg細胞的表達 圖2為各組代表性的Treg細胞，圖中右上象限的綠色細胞即為CD25+CD4+FoxP3+的Treg細胞。圖2A為正常對照組小鼠肺部的Treg細胞；圖2B為生理鹽水治療的小鼠，其肺部腫瘤細胞中Treg細胞的表達；圖2C為經紫杉醇治療后的小鼠，其肺癌局部Treg細胞；荷瘤小鼠肺部腫瘤中Treg細胞的表達（25.46%±2.23%）明顯高于正常對照組的小鼠（12.46%±1.21%）（P＜0.001）；紫杉醇化療組小鼠肺部腫瘤組織中Treg細胞的表達為17.53%±1.24%，明顯低于腫瘤組（25.46%±2.23%）（P=0.004）（表2）。

表 1 各組小鼠肺腺癌細胞中TAP-1和TAP-2的表達Tab 1 The expression of TAP-1 and TAP-2 in each group

圖 1 流式分析Treg細胞。根據前向散射儀（FSC）和側向散射儀（SSC）的參數勾勒所需分析的細胞，為R1（A）；在R1細胞群中勾勒CD25、CD4雙陽性的細胞，為R2（B）；在R2細胞群中分析陽性表達FoxP3的細胞，即為Treg細胞（C）。Fig 1 Analysis Treg cells using FACS. According to the FSC and SSC, R1 (A) was gated； In R1 region, double staining (CD25 and CD4) cells weredefined as R2 (B)； In R2 region, Treg cells were defined as positive expression of FoxP3 (C).

圖 2 各組一例典型Treg細胞在小鼠肺部組織的表達。A：正常小鼠肺部的Treg細胞（15.56%）；B：生理鹽水治療的肺癌小鼠肺部的Treg細胞（21.48%）；C：紫杉醇治療的肺癌小鼠肺部Treg細胞（18.64%）。Fig 2 One typical case of Treg cells expression in each group. A: in lung tissue of normal mice (15.56%)； B: 3LL bearing mice pretreated with saline(21.48%)； C: 3LL bearing mice pretreated with paclitaxel (18.64%).

3 討論

TAP是參與腫瘤抗原遞呈的重要蛋白，TAP蛋白有兩個亞單位組成：TAP1，TAP2。它們負責將細胞內處理完成的抗原肽段轉運到內質網。如果腫瘤細胞表面的TAP蛋白表達下降，將會導致腫瘤細胞的主要組織相容性復合物I類分子（major histocompatibility complex-I,MHC-I）的表達下降或缺如[4-6]，結果是腫瘤不呈現或僅呈現弱的抗原性，導致腫瘤抗原無法被遞呈給CD8+的T細胞，從而逃脫免疫監管；這是腫瘤免疫逃逸的一個重要機制；而腫瘤免疫逃逸的另一個重要機制是指外周耐受，即調節性T細胞的免疫抑制作用；調節性T細胞（Treg細胞）是一組具有免疫抑制功能的CD4+CD25+T細胞亞群，通過以下機制促進腫瘤的免疫逃避：①通過細胞接觸依賴性機制或分泌IL-10、TGF-B的細胞因子抑制免疫細胞的功能；②通過與效應細胞競爭性結合IL-2抑制其增值；③誘導抗原遞呈細胞向免疫耐受方向發展[7]。

表 2 各組小鼠腫瘤局部的Treg細胞表達的比較Fig 2 The expression of Treg cells in each group

作為肺部腫瘤治療的重要組成部分——化學治療，在肺癌的免疫逃逸中發揮什么樣的作用成為近年來研究的熱點；紫杉醇是目前肺癌化療中的首選藥物；作為抗微管的化療藥物，干擾了微管系統中的動態平衡，使細胞分裂停止在細胞周期的G2晚期和有絲分裂期，從而抑制肺癌細胞的復制。本研究試圖闡明紫杉醇對于逆轉肺癌逃脫免疫監管的內在機制；

我們的研究選擇體外5×10-8mol/L紫杉醇的濃度，因為5×10-8mol/L紫杉醇曾經被證實能刺激體內抗原遞呈細胞發揮作用[3]，對應于體外5×10-8mol/L的紫杉醇，小鼠腹腔內的紫杉醇注射用量是0.012 5 mg/只[3]。

本研究指出，紫杉醇具有逆轉腫瘤細胞表面降低表達TAP-1、TAP-2蛋白的作用；表現為紫杉醇上調腫瘤細胞表面MHC-I類分子的表達。此外，本實驗還證實了紫杉醇有利于消除調節性T細胞的抑制作用；Treg細胞的檢測在技術上一直是個難點，本研究采用流式三染的技術，將表達CD25、CD4 雙陽性的細胞再進行細胞內叉頭蛋白（FoxP3）的染色。本研究指出，紫杉醇的化療消除了調節性T細胞在腫瘤免疫中的抑制作用；本研究證明，化療并不是以往認為的與機體的免疫是對抗或拮抗的；當選擇適當劑量的時候，化療藥物可通過促進腫瘤抗原的暴露，消除調節性T細胞促進Th1免疫反應，從而促進抗腫瘤免疫應答的發生；從這點而言，化療藥物對于重建機體的免疫格局具有其獨特的貢獻。

進一步地，本研究將繼續研究化療藥物對于免疫記憶細胞的影響；因為理論上，化療藥物成功殺傷腫瘤細胞，協同免疫系統清除腫瘤抗原，為記憶細胞的分化提供靜止期；另一方面，化療后機體經歷淋巴細胞的自穩性增生，使得腫瘤抗原特異性效應細胞的比例大大增加，使更多的細胞分化為相應的記憶細胞[8,9]。

總之，依據化療后腫瘤細胞免疫原性的變化，設計相應的治療方案，將化療和免疫治療有機的結合，將最終提高抗腫瘤效應，為臨床實踐帶來新思維。