dlk1促進肺鱗癌細胞增殖的相關分子機理研究

劉宇 譚金晶 李琳 李碩 鄒霜梅 張瑩 張曉靜 凌兵 韓迺珺 郭素萍 高燕寧

肺癌嚴重危害人類健康與生命。2008年美國肺癌新增病例數及死亡病例數分列各種腫瘤的第二位及第一位[1]。中國國家衛生部公布的資料[2]顯示，在過去30年間肺癌死亡率上升了465%，已經成為我國惡性腫瘤死亡的首位原因。肺癌的發生是基因與環境相互作用的結果，其中涉及到多種癌基因的激活與抑癌基因的失活[3,4]。本實驗室利用基因芯片技術對82例肺鱗癌患者的腫瘤組織與配對癌旁組織的mRNA表達譜分析顯示，dlk1基因在肺鱗癌中表達水平顯著高于癌旁正常組織（尚未發表的資料），提示dlk1基因可能在肺鱗癌的發生演進過程中起促進作用，值得深入研究。

dlk1基因別名FA1、ZOG、Pref-1，定位于人14號染色體長臂14q32，編碼含383個氨基酸的蛋白質DLK1，屬父源性印跡基因。DLK1蛋白由N端的信號肽，6個EGF結構域，一個跨膜結構域及C端的胞內肽段組成，屬于表皮生長因子類家族蛋白，與Notch/Delta/Serrate蛋白具有一定的同源性。其蛋白結構與其同源蛋白DLL1相比，缺少N端的DSL結構域[5]。dlk1基因在大部分成體動物組織中處于沉默狀態。根據GeneCards數據庫（http://www.genecards.org/）中基因表達序列分析（Serial Analysis of Gene Expression）數據預測dlk1基因在人不同組織中的表達，結果表明，該基因在胎盤組織高表達，而在大部分正常組織中均不表達。最近的研究發現，dlk1基因在多種腫瘤中出現異常表達，如在腦膠質瘤、肝癌組織中表達水平均高于正常組織[6,7]；且dlk1在肝癌中的高表達與肝癌病人預后不良相關[8]。而在腎癌中dlk1基因較正常組織低表達[9]。目前，dlk1基因與肺鱗癌的關系尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究入組病例均為中國醫學科學院腫瘤醫院胸外科收治的肺癌患者，術前均未接受放射治療或化學治療。全部患者均接受了規范的肺癌根治手術及區域淋巴結清掃治療。組織病理學診斷依據國際抗癌聯盟（International Union Against Cancer, UICC）2002年標準。人肺鱗癌細胞株H520源自美國ATCC；真核表達載體pcDNA3.1-Myc（His）購自Invitrogen公司；DLK1抗體購自Abcam公司；CyclinB1抗體購自Santa Cruz公司；Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒購自日本同仁化學研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 肺鱗癌細胞H520在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，于37oC、5%CO2條件下常規貼壁培養。待細胞生長匯合度達80%左右時，以含0.2%EDTA的0.25%胰酶消化細胞，進行常規傳代。

1.2.2 反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR） 提取組織或細胞總RNA，取1 μg總RNA按照Invitrogen反轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。取1 μL反轉錄后的cDNA為模板進行PCR反應。dlk1引物F：5'-AAGGACTGCCAGAAAAAGGAC-3'，R：5'-GCAGAAATTGCCTGAGAAGC-3'；產物長度138 bp。18s引物F：5'-GAAACGGCTACCACATCC-3'，R：5'-ACCAGACTTGCCCTCCA-3'，產物長度167 bp，退火溫度均為60oC。

1.2.3 dlk1基因的克隆和真核表達質粒的構建 根據NCBI數據庫中dlk1基因mRNA序列信息（Accession Number: NM_003836.4）設計克隆引物，在上游引物中含有NheI酶切位點，下游引物含有HindIII酶切位點。PCR擴增dlk1基因全長開放讀碼框（ORF）。產物經純化、酶切后，連進入真核表達載體pcDNA3.1/myc-His(-)。連接產物轉化感受態細胞，并篩選獲得成功轉化的陽性克隆進行后續鑒定。dlk1克隆引物F：5'-CCCAAGCTTGGGGATCTCCTCGTCGCCG-3'，R：5'-CCCAAGCTTGGGGATCTCCTCGTCGCCG-3'；產物長度1 257 bp，采用兩步法進行擴增，退火及延伸溫度均為72oC。

1.2.4 脂質體介導的細胞轉染 按LipofectamineTM2000產品說明書操作。待細胞生長至70%-90%融合時進行轉染，將混勻的質粒與脂質體加入細胞培養液中，于37oC、5%CO2條件下培養。并于4 h-6 h后更換新鮮培養基。在轉染質粒24 h后，培養基中加入G418（500 μg/mL）篩選穩定表達外源基因的細胞，分別命名為H520-dlk1及H520-pcdb。

1.2.5 細胞生長曲線的繪制 參照生產商說明書進行實驗。將一定數量的細胞種于96孔板中，37oC常規培養，并記為第0天。測定細胞活性時，按照100 μL培養基加入10 μL CCK8溶液的比例稀釋CCK8；更換細胞培養基后，將稀釋好的CCK8溶液加入孔板中；37oC培養2 h，并于450 nm波長下測定吸光度值。

1.2.6 Western blot分析 采用RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白，BCA Protein Assay Kit對蛋白進行定量。取80 μg變性后的蛋白進行實驗。所用抗DLK1抗體及抗CyclinB1的抗體稀釋度分別為1:100及1:1 000，并用ECL發光試劑檢測目的蛋白表達。

1.3 統計學分析 采用R統計分析平臺對實驗結果進行分析，以t檢驗進行統計學分析，以P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 dlk1基因在肺癌組織中的表達 通過RT-PCR方法在30例非小細胞肺癌（其中鱗癌16例，腺癌14例）患者的組織及其配對癌旁正常組織中檢測了dlk1基因mRNA的表達情況。結果顯示，dlk1基因在36.7%（11/30）的非小細胞肺癌組織中較癌旁組織高表達（圖1，差異表達倍數≥2.0）。

圖 1 dlk1基因在30例非小細胞肺癌組織及其癌旁正常組織中的表達。A：dlk1基因在非小細胞肺癌組織中表達情況的瓊脂糖凝膠電泳示意圖，18s為內參對照基因；B：dlk1基因在30例非小細胞肺癌組織與其配對癌旁正常組織表達情況的比較。Fig 1 Expression pattern of dlk1 in 30 non-small cell lung cancer(NSCLC) specimens and the paired adjacent normal lung tissues. A:Representative results of RT-PCR of dlk1 from NSCLC (T) and their adjacent non-cancerous lungs (N), where 18s was employed as internal control； B: A histogram represents the relative expression of dlk1 among 30 NSCLC specimens and their adjacent normal lung tissues.

2.2 含正確dlk1基因序列的真核表達載體的獲得 隨機挑取不同的5個菌落，小規模制備質粒DNA后，經酶切電泳鑒定，1-3號質粒中插入了目的基因dlk1（酶切產物長度與PCR產物長度一致，圖2）。取這3個細菌克隆提取質粒，經測序鑒定顯示，2號質粒與NCBI數據庫中目的序列一致，用作后續實驗研究。

圖 2 不同菌落小規模制備質粒DNA后經限制性核酸內切酶雙酶切后電泳圖。M：DNA Lader，1-5為質粒編號。插入的目的基因長度為1 257 bp，真核表達載體pcDNA3.1長度為5.5 kb。Fig 2 Electrophoretogram of 5 different plasmids digested by restriction endonuclease. M: DNA Lader, 1-5: plasmid ID. The inserted fragment of target gene dlk1 was 1 257 bp and the vector pcDNA3.1 was 5.5 kb in length.

2.3 穩定表達外源性dlk1基因的H520細胞的獲得與篩選分別收集作為空白對照的親本H520細胞、H520-pcdb和H520-dlk1細胞，提取細胞RNA及蛋白質。分別進行RTPCR（圖3A）及Western blot（圖3B）分析。結果顯示，H520-dlk1細胞中在RNA及蛋白水平均可檢測到外源性dlk1基因的表達，而在空白H520細胞及空載體H520-pcdb細胞中，均未檢測到dlk1，表明已經成功篩選獲得穩定表達外源性dlk1基因的H520細胞，用于后續研究。

圖 3 外源性dlk1基因在H520細胞中的表達鑒定。A：RT-PCR檢測dlk1基因在空白H520細胞、H520-pcdb細胞及H520-dlk1細胞中的表達，M：Marker，NTC：無模板的PCR陰性對照，胎盤組織cDNA為陽性對照，18s為內參對照基因。B：Western Blot檢測DLK1蛋白在上述3種細胞中的表達，GAPDH為內參對照。Fig 3 The expression of dlk1 in H520 cell was examined by both RTPCR and Western blot analysis. A: RT-PCR analysis of dlk1 expression in blank H520, H520-pcdb and H520-dlk1 cells. M: Marker, NTC: none template control, placenta cDNA was used as positive control. B:Western blot analysis of dlk1 expression.

2.4 dlk1基因過表達對肺鱗癌細胞增殖的影響及其調控的分子機制 以CCK8方法繪制細胞生長曲線，觀察穩定表達dlk1基因對細胞增殖能力的影響，并采用平板集落形成實驗對這一現象進行驗證。如圖4A所示，穩定表達dlk1基因的H520-dlk1細胞與轉染空載體的H520-pcdb細胞及空白的H520細胞相比細胞生長速度明顯加快，而空載組H520-pcdb與空白組H520細胞相比細胞生長速度則無明顯差別。平板集落實驗結果（圖4B）同樣發現穩定表達dlk1基因可以促進H520細胞的集落形成能力。同樣條件下，H520-dlk1細胞的集落形成數量與H520-pcdb組及H520空白組相比均有明顯增加，結果有統計學意義。而空載體組與空白組細胞間無統計學差異。

圖 4 穩定表達dlk1基因對細胞體外增殖能力的影響。A：以CCK8繪制細胞生長曲線。橫坐標為時間（單位天），縱坐標為CCK8在450 nm處的OD值。B：細胞集落形成實驗結果及計數柱形圖（*t-test，P＜0.05）。Fig 4 dlk1 accelerates cell proliferation in vitro. A: CCK8 analysis based cell growth curve. X axis represents time in days while Y axis is the absorption of CCK8 in 450 nm. B: Clone forming assay representations and histogram of the clone counts (*t-test, P＜0.05).

2.5 dlk1基因過表達對細胞周期蛋白CyclinB1表達水平的影響 利用Western blot技術，對細胞中CyclinB1的表達情況進行了分析。結果發現（圖5），與空載組H520-pcdb及空白組H520細胞相比，穩定表達DLK1蛋白的H520-dlk1細胞中CyclinB1的表達明顯上調，結果具有統計學意義。而空載組與空白組間無明顯差異。

圖 5 穩定表達dlk1基因對細胞中CyclinB1表達水平的影響。柱形圖中縱坐標為以Gapdh為內參對照基因矯正后的CyclinB1相對表達量（*t-test，P＜0.05）。Fig 5 dlk1 induces CyclinB1 expression in H520 cells. The histogram represents the relative expression of CyclinB1 adjusted by housekeeping gene Gapdh (*t-test, P＜0.05).

3 討論

本實驗室前期針對82例肺鱗癌患者的腫瘤及其對照組織的mRNA表達譜分析發現，dlk1基因在肺癌組織中較癌旁正常組織高表達（尚未發表的資料）。本項研究采用另外30例非小細胞肺癌腫瘤及配對癌旁組織證實了dlk1基因確實在非小細胞肺癌中存在異常高表達。此外，本項研究的預實驗顯示，dlk1基因在一系列非小細胞肺癌細胞系中表達。為進一步探討dlk1基因的分子功能，我們選擇了不表達內源性dlk1基因的肺癌細胞系H520作為模型，進行后續體外實驗研究。

細胞周期調控失效、細胞無限增殖是腫瘤細胞的特征之一。已有研究發現，腫瘤細胞中一系列細胞周期相關蛋白出現異常高表達，其中包括CyclinD1[10,11]、CyclinE[12,13]、CDC25A[14]等。而細胞的分化與增殖是一組對立的關系。在生物體內，處于終末分化狀態、行使特定功能的細胞往往不具有增殖的能力。相反，保持旺盛增殖能力的細胞均為干細胞，并不具有特定的細胞行為。dlk1參與多種細胞分化過程的調節，其功能必然與細胞的增殖有某種關系。Huang等[7]報道，過表達DLK1蛋白可以導致肝癌細胞系SMMC-7721增殖加快，而利用siRNA抑制內源性dlk1基因表達可以降低細胞體外集落形成率，并抑制細胞在裸鼠體內的成瘤性。Yin等[6]在對腦膠質瘤的研究中得到了同樣的結果，并且發現dlk1基因高表達可引起CyclinD1、CDK2、E2F1等蛋白表達上調，并認為這可能是其引起的細胞增殖加快的可能原因之一。Kim[15]與Ruiz-Hidalgo[16]等研究發現dlk1基因可以引起ERK蛋白磷酸化，進而激活MAPK信號通路，并且這種激活作用存在劑量、時間依賴關系。考慮到腫瘤異質性以及腫瘤微環境對腫瘤的影響，dlk1基因在不同腫瘤中的作用及分子機制可能存在差別，而其在肺癌發生發展中的作用尚不清楚。我們利用穩定表達dlk1基因的H520肺癌細胞模型研究dlk1基因與肺癌細胞增殖之間的關系。結果顯示，穩定表達dlk1基因可以顯著增加細胞的增殖速度，并可以增加細胞的集落形成能力（圖4）。這與文獻中的報道是一致的。

進一步的Western blot結果則顯示，穩定表達dlk1基因后，可以引起CyclinB1表達的上調（圖5）。Cyclin家族蛋白是一類細胞周期相關蛋白，不同類型的Cyclin蛋白在細胞周期的不同階段特異性表達，從而調控細胞周期的有序、正常進行。研究表明，CyclinD在整個細胞周期中均有較高表達，其與CDK4/5結合，在細胞周期G1/S期轉換過程中起到調控作用。而CyclinB在細胞進入S期后開始出現表達，其表達水平的峰值出現在細胞由G2期進入M期過程中。CyclinD與CyclinB1分別在細胞周期的G1/S及G2/M檢驗點起到調控作用。以往的報道均集中于dlk1基因高表達引起的CyclinD表達上調及細胞由G1期進入S期的增加，卻沒有對細胞周期中其他蛋白表達水平變化的相關報道。我們則發現dlk1基因高表達可以導致CyclinB1表達水平上調，提示dlk1基因可能通過作用于多個細胞周期相關蛋白，在多個細胞周期檢驗點中調節細胞的增殖能力，這為dlk1基因引起的細胞增殖能力增強的分子機制提供了新的線索。

在獲得上述結果的基礎上，我們還應注意到，雖然DLK1屬于表皮生長因子類家族蛋白，但其與DLL1相比缺少DSL結構域，而這個結構域在激活下游信號通路中起著重要作用，提示DLK1蛋白可能通過其他途徑向胞內傳遞信號，調節細胞增殖。因此，準確鑒定DLK1的相互作用蛋白及其參與調控的胞內信號通路具有重要意義，需要進一步的實驗進行研究。