不同來源番茄潰瘍病菌致病力差異研究

王 蕊, 羅來鑫, 李健強

(中國農業大學植物病理系,農業部植物病理學重點開放實驗室,北京 100193)

番茄潰瘍病是一種嚴重危害番茄生產的細菌性病害,普遍發生在世界各大番茄主產區[1-2]。美國、加拿大、意大利、英國、土耳其等番茄生產大國均有報道,成為制約當地番茄生產的重要因素。該病害病原菌為密執安棒形桿菌密執安亞種(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)(以下簡稱Cmm)。我國在北京、黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、新疆、河北、山西、山東、上海、海南等地都有番茄潰瘍病的發生和危害[3-4],使番茄制種及大田生產受到不同程度的影響。目前,國際上對番茄潰瘍病的研究多集中在病原菌致病基因表達、病害防治等方面[5],關于不同來源的病原菌致病力差異方面報道很少;我國亦尚無研究進展報道。研究不同來源番茄潰瘍病菌的致病力差異,是探索該病菌多態性以及開展致病機制等其他相關研究的重要基礎。國內外關于包括番茄潰瘍病菌在內的植物病原細菌的接種方法已報道有剪葉法、浸根法和針刺法等[6]。作者在2004年報道使用打頂法進行番茄潰瘍病菌的接種[7],簡單易行,結果可靠[8],可以作為研究大量不同菌株致病力差異的方法。

本文以46株來源于3個國家不同地區的番茄潰瘍病菌為研究材料,采用打頂法接種2～3葉期番茄幼苗,通過調查病情指數來評價不同菌株的致病力強弱,并利用半選擇性培養基分離和特異性PCR等方法,對來自發病幼苗的分離物進行了驗證,證實來自于病株的分離物均為原接種的番茄潰瘍病菌。結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供試番茄品種為佳粉10,為我國華北的主栽品種。育苗基質按V(菜田土)∶V(草炭)∶V蛭石=1∶1∶1的比例配制,經160℃干熱滅菌5 h,冷卻后裝入72穴(6行×12列)育苗盤中,用水充分浸潤基質24 h,隨后播種番茄種子,每穴2～3粒,在溫室中(日平均氣溫為26℃左右,夜間最低溫度控制在15～18℃,白天最高溫度為32～35℃;相對濕度控制在30%～60%,日平均相對濕度為42%)育苗;播種后7～10 d間苗,每穴選留1株長勢均勻健壯的幼苗,培育至2～3片真葉期供接種用。

1.1.2 供試菌株

供試菌株包括作者所在研究室不同年份分離自我國不同地區番茄潰瘍病發病田植株并經特異性PCR驗證初步鑒定為Cmm的菌株,以及與國內外同行交換或接受饋贈獲得的共計46株,具體信息見表1。

表1 供試菌株基本信息

1.1.3 培養基

YDC培養基:10 g酵母提取物、20 g CaCO3超微粉(Sigma,No.C-6763)、20 g葡萄糖、15 g瓊脂、去離子水1000 mL,121℃滅菌 20 min,冷卻至50℃后制備平板備用。

mSCM 培養基:2.62 g K2HPO4?3H2O、0.5 g MgSO4?7H2O 、1.5 g硼酸 、10 g 甘露糖、0.1 g 酵母提取物、15 g瓊脂溶于980 mL蒸餾水中,滅菌后加入100 mg煙酸(溶于20 mL無菌水)、30 mg萘啶酮酸鈉鹽(溶于1 mL 0.1 mol/L NaOH)、200 mg放線菌酮(溶于1 mL無水甲醇)。

LB液體培養基:酵母提取物5 g,胰蛋白胨(tryptone)10 g,氯化鈉5 g,去離子水1000 mL。

1.1.4 引物

選取Luo[9]等設計的Cmm特異性引物spm 4f/2r進行分離物的PCR鑒定。

序列如下 :spm 4f 5′-TCAGGCGTCTGT TCTGGC-3′和 spm 2r 5′-CCCACCACCATCCACAAC-3′,由北京三博遠志公司合成。

1.2 研究方法

1.2.1 接種體的制備

將凍存于-86℃超低溫冰箱的Cmm菌株于YDC培養基平板上進行活化,活化好的菌株在YDC培養基上培養72 h后,挑取單菌落在LB液體培養基中搖培24 h,通過平板計數法確定菌液濃度達到109cfu/mL后備用。

1.2.2 接種方法

采用作者2004年報道的打頂法進行接種。即使用14 cm手術剪(型號:PT J-3)的前端1 cm蘸取菌懸液后在番茄幼苗子葉上部1～2 cm處將主莖剪斷,每株菌株的接種處理設3個重復,每個重復接種5株番茄幼苗,以無菌水為空白對照。接種幼苗在1.1.1所述溫室中培養,適時澆水保證秧床土壤濕潤。接種后21 d,調查記錄發病情況,計算病情指數。參照羅來鑫等的方法對番茄幼苗的潰瘍病進行分級[8]:0級,不出現葉片(或子葉)萎蔫或莖壞死;1級,葉片(或子葉)輕度變黃或萎蔫;2級,葉片(或子葉)中度萎蔫或莖輕度壞死;3級,葉片(或子葉)嚴重萎蔫或莖嚴重壞死;4級,植株死亡。依照下列公式計算病情指數:

1.2.3 病原菌的分離

分別取各菌株接種發病的顯癥植株3株,剪取病苗1～2 cm莖段,置于滅菌后的培養皿內加1～2滴無菌水,擠壓出莖部組織液,用接種環蘸取組織液在ISTA推薦的Cmm半選擇性培養基mSCM平板上畫線,25～28℃下培養7～14 d,挑取中部具有小黑點的淺黃色單菌落,在YDC培養基平板上純化。

1.2.4 分離物的PCR檢測

使用Cmm亞種特異性的引物Spf4f/2r對上述分離物的菌懸液進行 PCR擴增,25 μ L反應體系中,PCR緩沖液為1×的工作濃度,4種dNTP濃度均為 200 μ mol/L,正向和反向引物濃度均為0.4 μ mol/L,Taq DNA 聚合酶(天根生化公司產品)1.25U。反應條件為:94℃預變性5 min;隨后94℃變性30 s,60℃退火40 s,72℃延伸40 s,35個循環;最后72℃延伸7 min,置于4℃保持。將得到的PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后在凝膠成像儀(Alpha Innotech公司)觀測是否得到特異性擴增產物并拍照。

2 結果與分析

2.1 不同來源番茄潰瘍病菌致病性測定結果

接種21 d后觀測,在46株不同來源的番茄潰瘍病菌中,大部分菌株表現出致病性(見圖1),其中ZY-0501和01-Cmm病情指數為0,其余44菌株均表現出不同程度的致病性,具體病情指數見表2。具有致病性的菌株中,弱致病性菌株9株,占供試菌株的19.6%,中等致病性菌株11株,占供試菌株總數的23.9%。強致病力菌株24株,占供試菌株總數的52.2%。

2.2 接種后發病植株的選擇性培養基分離結果

通過使用半選擇性培養基mSCM,從顯癥植株能夠再次分離獲得培養性狀與原接種體一致的菌落,經純化后的分離物在YDC培養基上呈黃色黏稠狀菌落(見圖2)。而從無菌水接種處理的幼苗上未能分離獲得培養性狀與Cmm相似的菌落。

2.3 分離物的PCR鑒定結果

使用具有亞種特異性的引物Spm4f/2r對接種后發病植株的純培養分離物進行PCR擴增(菌株ZY-0501和01-Cmm接種后未造成番茄幼苗癥狀,故未獲得再分離培養物),擴增產物經染色和電泳后,可見到特異性的223 bp擴增片段(見圖3)。

表2 不同來源番茄潰瘍病菌致病力差異

3 結論與討論

研究結果表明,利用打頂法可較好地測定不同來源番茄潰瘍病菌的致病力差異,根據病情指數可將病菌分為強、中、弱等不同的致病類型,而來自同一地區不同年份、同一地區同一年份不同田塊的菌株致病力也可能存在顯著差異。從發病幼苗分離Cmm時,使用mSCM半選擇性培養基可以避免其他雜菌及腐生菌的污染,從而有效地分離到目標菌。

本研究中所選用的番茄品種佳粉10為我國華北地區主栽品種。在預試驗中,作者采用3個品種作為供試的番茄品種,分別為佳粉10、合作908、華南紅寶石,結果顯示,3個不同供試品種對同一菌株的感病性沒有顯著差異。本研究由于供試菌株數量較多,以及試驗條件的限制,只有部分菌株在2個番茄品種(佳粉10及華南紅寶石)上進行了致病性測定,結果同樣表明這兩個番茄品種對同一菌株的感病性沒有顯著差異,表明同一Cmm菌株的致病力在不同番茄品種之間沒有顯著差異。目前國外雖然有文獻報道,在一些與栽培番茄有親緣關系的野生種中,發現了一些對Cmm具有中度抗性的種質資源,但世界上尚無商品化的番茄潰瘍病抗性品種[12-13],這也是番茄抗病育種急需解決的難題之一。

番茄潰瘍病近年來在國內外發生危害比較頻繁,其中在我國甘肅、河北、內蒙古等番茄制種基地和生產田均有不同程度發生,而不同來源番茄潰瘍病菌的致病力差異尚未見報道。調查不同來源潰瘍病菌的致病力差異是探索該病菌多態性以及開展其他相關研究的重要基礎。本研究供試的番茄潰瘍病菌中,26株菌株采自國內3個省份6個不同的地區,其中來自新疆的菌株XJ-11、XJ-15致病力較強,病情指數均達到100,因此應注意對該地區番茄潰瘍病的調查及預防,避免發病田塊種子遠距離傳播。在20株國外菌株中,來自新西蘭的7株大部分沒有表現出強致病力,可能與這些菌株經過多次轉代培養部分致病力喪失有關,也可能與國內的番茄品種對這一地區的Cmm菌株存在一定抗性有關,這些菌株在中國的適生性還有待進一步研究。本研究中不同來源的Cmm菌株顯現出致病力差異是否是菌株內在分子水平的不同導致,還需要通過rep-PCR、AFLP等手段進一步分析,目前該研究正在進行中。

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