骨髓間充質干細胞移植修復大鼠半橫斷脊髓損傷

吳金生,董愛萍,王曉萃,魏志新,劉偉光,欒志敏,祝增軍

(1.山東濰坊醫學院附屬醫院泌尿外科,山東濰坊 261053;2.濰坊藍天醫院,山東濰坊 261042; 3.濰坊醫學院人體解剖學教研室,山東濰坊 261053;4.濰坊醫學院形態學實驗室,山東濰坊 261053)

研究報告

骨髓間充質干細胞移植修復大鼠半橫斷脊髓損傷

吳金生1,董愛萍2,王曉萃3,魏志新4,劉偉光1,欒志敏1,祝增軍1

(1.山東濰坊醫學院附屬醫院泌尿外科,山東濰坊 261053;2.濰坊藍天醫院,山東濰坊 261042; 3.濰坊醫學院人體解剖學教研室,山東濰坊 261053;4.濰坊醫學院形態學實驗室,山東濰坊 261053)

目的 初步探討骨髓間充質干細胞誘導為神經細胞,及其移植對大鼠脊髓半橫斷損傷神經功能恢復和運動的影響。方法貼壁培養法分離培養大鼠骨髓間充質干細胞(m esenchym al stem cells,M SCs),大鼠脊髓勻漿上清誘導第3代向神經細胞分化,經免疫組化鑒定分化后細胞的性質。制備大鼠半橫斷脊髓損傷模型,脊髓損傷局部注射B rdU標記誘導后的神經細胞。細胞移植5周后觀察移植細胞在脊髓內存活分布情況。結果倒置顯微鏡下可見M SCs呈紡錘形和多角形,有1～2個核仁,經脊髓勻漿上清誘導后,發出數個細長突起,并交織成網,誘導后的細胞表達Nestin,可推測誘導后的細胞為M SCs源神經細胞。5周后移植的M SCs在宿主損傷脊髓內聚集并存活,表達MAP-2、NF、GFAP與對照組比較有統計學意義(P<0.05)。大鼠運動功能較移植前有所改善。結論M SCs經脊髓勻漿上清誘導后移植治療大鼠半橫斷脊髓損傷可使運動功能得到改善。

間充質干細胞;脊髓損傷;誘導分化;細胞移植;大鼠

脊髓損傷(sp inal cord in jury,SC I)是常見的嚴重創傷,脊髓損傷發生后,損傷部位的神經軸突被撕裂,神經元和神經膠質細胞死亡,幸存的軸突發生脫髓鞘改變,這些最終導致脊髓喪失傳導下行的運動沖動和上行的感覺沖動的能力,患者發生癱瘓。長期以來,SC I的治療一直是一個難題。骨髓間充質干細胞(m esenchym al stem cells,M SCs)是另外一種多功能干細胞,具有多潛能性,M SCs不僅可分化為中胚層的骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞,而且能分化成外胚層的神經元、神經膠質細胞及內胚層的肝細胞[1-3]。因此利用M SCs的橫向分化潛能,根據需要將其誘導分化為特定的組織細胞,用以修復受損的組織或器官。脊髓損傷、多發硬化癥、帕金森病和阿爾茨莫病都是可以用M SCs代替破壞或者無功能的細胞來進行治療的中樞神經系統疾病,因此用干細胞替換組織或細胞治療神經系統疾患逐漸成為研究的主要焦點。

1 材料與方法

1.1 主要動物、儀器及試劑

健康Sp rague-Daw ley(SD)大鼠,體質量200～220 g,雌雄不拘,軍事醫學科學院【SCXK(軍)2002-001】。Thermo CO2培養箱(美國),倒置相差顯微鏡(日本O lympus),激光共聚焦顯微鏡(LS M 5 Pascal)德國Zeiss公司,S W-CT-1FD超凈工作臺(中國), Labofuge-300低速離心機(德國),L-DM EM(美國Gibco),胎牛血清(杭州四季青生物有限公司),胰蛋白酶(美國Sigm a),nestin、MAP-2(兔抗大鼠微管相關蛋白,北京中杉生物技術公司),NF(兔抗大鼠神經絲蛋白,福建邁新生物技術公司公司)膠質纖維酸性蛋白(GFAP,北京中杉生物技術公司),B rdU (美國Sigm a公司),兔抗鼠B rdU二抗(北京中杉生物技術公司),羊抗兔TR ITC(北京中杉生物技術公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓M SCs的分離、培養和傳代[4]:健康SD大鼠,頸椎脫臼處死,無菌條件下完整取出胸椎-腰椎節段脊髓,立即用4℃預冷PBS洗去血跡,置于5 mL 4℃PBS液中進行勻漿、離心(2 000 r/m in,10 m in),取上清液先用200目網篩過濾,再用0.2μm的針頭濾器過濾,-20℃下冷凍保存備用。

1.2.2 脊髓勻漿誘導后細胞免疫組化鑒定:覆有誘導細胞的蓋玻片用0.01 mol/L PBS洗滌3次,后用4%中性甲醛固定30 m in,PBS洗滌,過氧化物酶阻斷,非免疫動物血清孵育30 m in,加NSE、NF抗體,4℃過夜,加入生物素標記的第二抗體,鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液,DAB溶液顯色,蘇木素復染,中性樹膠封固,在顯微鏡下觀察。細胞免疫組化染色后光鏡下隨機數取10個非重疊視野(×100),計算nestin、NF陽性細胞分別占總細胞數的比例。

1.2.3 脊髓損傷動物模型的建立:水合氯醛(30 m g/kg)腹腔注射麻醉,以TS棘突為中心取背部后正中切口長約5 cm,顯露T7-T11棘突及椎板。咬除T9棘突及全椎板,11號尖刀片在左側造成脊髓半橫斷模型。術后縫合。圖1、2(彩插7)。

1.2.4 細胞移植及組織學觀察:M SCs移植組使用微量注射器約45度斜角(針頭斜面向下)將經B rdU標記的M SCs細胞懸液緩慢注入到脊髓半切頭側和尾側損傷臨近區域的灰白質交界處(距脊髓表面約0.7 mm),總細胞數6×105細胞,注射時間10 m in,留針5 m in,醫用生物蛋白膠封閉注射孔。對照組依同樣方法注射等量PBS緩沖液。手術或細胞移植后72 h、7 d、5周灌注固定觀察移植后細胞存活情況。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠骨髓M SC s的形態特點

采用貼壁培養法培養大鼠骨髓M SCs。培養24 h,部分細胞貼壁生長,隨后有微小突伸出,懸浮于培養液中的紅細胞隨換液減少。培養7 d后,細胞不斷分裂增殖,形成明顯的細胞集落。培養10～14 d,細胞貼滿瓶底,呈梭形,待細胞生長至80%融合時進行傳代。傳代后的細胞24 h即貼壁、伸展為三角形、多角形,并逐漸變成短梭形、長梭形,胞質豐富,細胞核圓形,體積較大,可見到明顯的核仁(圖3A)。

2.2 大鼠脊髓勻漿上清液誘導后細胞的形態變化

誘導24 h,細胞形態逐漸變成細長梭形,排列規則。48 h細胞形態逐漸出現改變,胞體折光性強,相互交織,類似神經細胞樣(圖3B)。對照組細胞形態則未見明顯變化。經脊髓勻漿上清誘導48 h后,大多數細胞表現為nestin陽性,胞質著紅色熒光,誘導72 h陽性表達加強(圖3C);誘導前細胞不表達nestin。

2.3 細胞移植后激光共聚焦顯微鏡、免疫組織化學觀察

M SCs源神經細胞移植后,共聚焦顯微鏡下觀察帶有熒光標記的B rdU細胞散在分布于脊髓內,細胞核著紅色,呈圓形、橢圓形(圖3D)。移植后脊髓免疫組織化學染色:MAP-2陽性反應定位于神經元的胞質,呈棕黃色(圖3E),移植后NF神經細胞胞質內棕黃色顆粒高表達(圖3F),GFAP表達陽性,細胞質內陽性著色(圖3G)與移植前陽性細胞數對比差異有顯著性(P<0.05)。見表1。

表1 術后5周各組切片M ap-2、GFAP陽性細胞數變化(±s,n=6)Tab.1 Changes ofM ap-2-and GFAP-positive cells at 5 weeks after treatm ent.(±s,n=6)

表1 術后5周各組切片M ap-2、GFAP陽性細胞數變化(±s,n=6)Tab.1 Changes ofM ap-2-and GFAP-positive cells at 5 weeks after treatm ent.(±s,n=6)

注:各組間均有差異,有統計學意義P<0.05Note:There are significant differences among the group s,P<0.05

組別Group MAP-2 GFAP對照組Control 16.3±4.5 17.5±3.0模型組Model 30.2±5.5 37.6±4.8 MSCs移植組61.2±3.5 65.9±3.63 Transp lantation

2.4 大鼠脊髓損傷行為學觀察

大鼠在術后8 h完全清醒,所有受試鼠均出現脊髓休克綜合征,采用BBB評分標準,術后3～4 d活動減少,飲食減少,尿儲留。細胞移植術3～4 d,飲食增加,活動增加,整個肌張力恢復過程:1～4 d遲緩性癱,雙后肢拖行,5～8 d痙攣性癱;8～12 d雙下肢恢復少量活動;12～16 d雙后肢活動逐漸恢復(表2)。

表2 M SCs移植術后各組大鼠行為評分(±s)Tab.2 The behavio ral scores after transp lantation in the rats of various groups.(±s)

表2 M SCs移植術后各組大鼠行為評分(±s)Tab.2 The behavio ral scores after transp lantation in the rats of various groups.(±s)

注:移植后與移植前行為學差異有顯著性,P<0.05Note:There were significant differences in the rat behavior before and after transp lantation.P<0.05

組別Group術后1 d 1 day after trasp lantation術后7 d 7 days after transp lan -tation術后14 d 14 days after transp lantation模型對照組Contro lmodel 2.44±2.40 5.13±3.36 9.13±4.55 M SCs移植組Transp lantation 2.50±2.67 10.71±6.24 15.00±6.60

2.5 超微結構觀察

電鏡觀察移植前后組織超微結構的變化:移植前脊髓灰質大部分神經元壞死,胞膜不完整,胞質內部分細胞器崩解,白質內,軸索萎縮,水腫,壞死,髓鞘增厚或脫髓現象(圖3H);移植后脊髓灰質部分神經元壞死,核內染色質溶解胞膜不完整,部分神經元結構尚可,胞質內線粒體發達,有些區域可見膠質細胞增生,白質內有髓神經纖維結構尚可,軸索結構完整(圖3 I)。圖3見彩插8。

3 討論

3.1 骨髓M SC s向神經元的誘導分化及鑒定

越來越多的研究結果表明骨髓M SCs具有多向分化潛能,它不僅可分化為中胚層來源的細胞,而且具有向神經細胞分化的潛能[5]。W oodbury等[3]用BM E、DM SO和丁羥基茴香醚(BHA)等具有還原性的物質將M SCs誘導成為神經元,也有學者[6]采用表皮生長因子(EGF)或腦源性神經生長因子(BDNF)與視黃酸的組合。聯合應用異丁甲基黃嘌呤( IBMX)和二丁基環磷酸腺苷(dbcAM P)提高細胞內cAM P的含量,亦可將M SCs轉變為神經元樣細胞[7]。有報道將M SCs與海馬腦片共同培養后, M SCs可分化為神經元樣細胞,表明在這兩種細胞共培養的過程中神經元可以提供給M SCs分化所必需的神經營養因子和細胞因子,此外,細胞間的相互接觸在M SCs向神經元的分化過程中發揮著重要的作用[8]。我們在以往的實驗中采用腦勻漿上清作為誘導劑將M SCS誘導為神經細胞取得了很好的效果[4]。為了更好地模擬M SCs在脊髓的生長分化情況,本實驗采用脊髓勻漿上清液作為生物性誘導劑誘導M SCs向神經元的分化,誘導后的細胞均表達神經元的特異性標志物NSE和nestin,不表達星形膠質細胞的標志物GFAP,且均具有神經元的特有結構—尼氏體,由此證明此方法均可將大鼠骨髓M SCs誘導分化為神經元而不是星形膠質細胞。

3.2 脊髓損傷動物的細胞移植療法

Harvey等[9]研究認為M SCs移植支持SC I后血管神經再生和神經網絡的重建。M SCs細胞移植的方法很多,李進領等[10]觀察M SCS通過靜脈與腹腔不同移植方法對脊髓損傷修復,細胞遷移途徑進行觀察,發現靜脈移植優于腹腔移植,尾靜脈注射的M SCs在損傷部位較未損傷部位明顯增多。馮大雄等[11]研究發現,脊髓損傷后靜脈注射M SCs 2、3、6周后,在損傷灶及其鄰近的損傷帶中可檢測到存活的M SCs,表明M SCs可通過血腦屏障,在脊髓內未見新生腫瘤的形成。A kiyam a等[12]將M SCs直接注射入SC I模型鼠脊髓后發現在再損傷的中心有明顯的髓鞘再生現象,損傷的邊緣也有部分髓鞘再生現象。骨質疏松是SC I的常見并發癥。李穎智等[13]研究發現脊髓損傷大鼠易發生骨質疏松癥,損傷平面上下骨質均受累,骨質疏松后骨細胞超微結構改變顯著,但不同部位改變程度不同,以損傷平面以下骨質受累較重。因此要及時治療脊髓損傷防止并發癥的發生。我們的實驗中直接將誘導標記后的細胞移植入脊髓損傷處,這樣既不能造成細胞的流失也增加損傷處的細胞量,移植后脊髓損傷動物在組織學和行為學的層次都有明顯改善。對移植前后大鼠脊髓超微結構觀察可見移植前脊髓灰質大部分神經元壞死,胞膜不完整,胞質內部分細胞器崩解,白質內,軸索萎縮,水腫,壞死,髓鞘增厚或脫髓現象;移植后脊髓灰質部分神經元壞死,核內染色質溶解胞膜不完整,部分神經元結構尚可,胞質內線粒體發達,有些區域可見膠質細胞增生,白質內有髓神經纖維結構尚可,軸索結構完整。脊髓損傷鼠在細胞移植術后3～4 d,飲食增加,活動增加,整個肌張力恢復過程:1～4 d遲緩性癱,雙后肢拖行,5～8 d痙攣性癱;8～12 d雙下肢恢復少量活動;12～16 d雙后肢活動逐漸恢復。通過免疫組織化學和行為學觀察,表明M SCs細胞移植后能夠在脊髓內存活,而且脊髓損傷大鼠的運動功能有所改善。

目前,在細胞移植治療SC I的領域中還有許多問題亟待解決:①如何引導軸突向合適的目標方向生長,進而建立功能聯系的機制還不清楚。②如果缺乏充足的營養,M SCs在移植部位壽命有限。③即使是自體移植的M SCs在分離培養擴增過程中會導致分泌細胞因子及合成表面受體能力下降,從而失去趨化、支持、營養等功能,甚至失去干細胞特性。隨著基礎研究、臨床實驗成果和經驗的不斷積累,M SCs極有可能在脊髓損傷治療這一世界難題中發揮不可替代的作用。

(本文圖1,2見彩插7,圖3見彩插8)。

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Bone M arrow M esenchym a l Stem Cell Tran sp lan ta tion in the Repa ir of Ra t Sp ina l Cord Hem isection In jury

WU Jin-sheng1,DONGA i-p ing2,WANG X iao-cui3,W EI Zhi-xin4,L IU W ei-guang1,LUAN Zhi-m in1,ZHU Zeng-jun1
(1.Departm ent ofU ro logy,A ffiliated Hosp ital ofW eifangM edical Co llegeW eifang 261053,China; 2.Lantian Hosp ital,W eifang 261042;3.Departm ent of Hum an Anatom y; 4.Labo ratory ofMorpho logy,W eifangM edical Co llege,W eifang 261053)

O b jective To investigate the differentiation of bone m arrow-derived m esenchym al stem cells into neurons and transp lantation of the stem cells to repair rat hem isection sp inal co rd in jury.M ethods Adherent cu lture was used to isolate and cu lture rat bone m arrow m esenchym al stem cells(M SCs).The rat sp inal cord homogenate supernatant was used to induce neural differentiation of the 3 rd generation cells.The nature of cell differentiation w as identified by imm unohistochem istry.The ratmodel of hem isection sp inal co rd in ju rywas p repared and B rdU was locally in jected to label the induced neurons.The distribution of living cells in the in juried sp inal cord was observed at 5 weeks after cell transp lantation.ResultsM SCswere sp ind le and po lygonal,w ith 1-2 nucleo li seen under the inverted m icroscope.A fter induction w ith sp inal cord homogenate supernatant there were a num ber of slender cytop lasm ic p ro jections form ing inter w ined netwo rk and show ing nestin exp ression,therefo re,indicating the neuronal nature.M SCs at 5 weeks after transp lantation into the sp inal cord in jurywere surviving and their exp ression ofMAP-2,NF,GFAPwas significantly higher than that in the control rats(P<0.05).The ratmotor function was imp roved than before transp lantation.Conc lusion M SCs induced by sp inal cord homogenate supernatant can be transp lanted into hem isection sp inal cord in jury and imp rove the motor function of the in juries lesions.

Bone m arrow;M esenchym al stem cells;Sp inal co rd inju ry;Induced differen tiation;Cell transp lantation;Rat

R651.2

A

1005-4847(2010)01-0056-04

2009-04-13

山東省濰坊市科學技術局資助項目(編號:200703035)。

吳金生,男,主治醫師,碩士學位.研究方向:干細胞誘導分化及移植。E-mail:w js w fm c@163.com