西藏小型豬細胞色素b基因序列的比較

李洪濤,肖東,顧為望,吳清洪,袁進,王萬山,張嘉寧

(1.廣州醫學院第一附屬醫院,廣州 510120;2.南方醫科大學實驗動物中心,廣州 510515)

研究報告

西藏小型豬細胞色素b基因序列的比較

李洪濤1,肖東2,顧為望2,吳清洪2,袁進2,王萬山2,張嘉寧2

(1.廣州醫學院第一附屬醫院,廣州 510120;2.南方醫科大學實驗動物中心,廣州 510515)

目的 對西藏小型豬Cyt b-基因序列進行分析,研究其遺傳背景及其與國內家豬的親緣關系。方法提取西藏小型豬和巴馬小型豬、貴州香豬、五指山豬的全基因組DNA,設計引物擴增Cyt b基因,測序后進行堿基序列比對,建立親緣關系樹,分析西藏小型豬的遺傳背景。結果西藏小型豬等國內部分品種豬的Cyt b基因序列與歐洲豬相比有14個變異位點;但是西藏小型豬與國內品種豬相比存在兩個特殊堿基位點即在420位點T→C轉換的同時在883位點存在G→A轉換。結論西藏小型豬與巴馬小型豬、貴州香豬、五指山豬等國內家豬有很近的親緣關系。同時進一步證實西藏小型豬群體內存在一定的遺傳分化。

西藏小型豬;細胞色素B基因;比較研究

細胞色素b(Cyt b)基因是m tDNA中重要的蛋白編碼基因,編碼細胞色素的一個亞基,它包含種間乃至到科間的進化遺傳信息,廣泛用來進行法醫學種屬鑒定[1,2]和脊椎動物種上和種下分類階元的系統進化研究,被認為是解決系統發育問題最可信的m tDNA標記之一[3]。國內學者對我國的黃牛品種[4]、綿羊[5]、山羊[6]的Cyt b基因遺傳多態性和系統發育關系進行了分析,對動物起源的研究有了更為科學的推斷。

豬的Cyt b基因堿基序列與人類以及牛、羊等哺乳動物一樣全長為1140 bp,同樣存在著廣泛的多態性,并按母系遺傳方式傳遞給下一代。在對西藏小型豬m tDNA控制區的研究中,根據m tDNA控制區串聯重復區的長度和重復片段存在異質性,將西藏小型豬體分為A型和B型[7]。母系系譜分析顯示,串聯重復區的排列類型同樣由母本傳給后代,與父本沒有關系。2004年南方醫科大學從西藏自治區工布江達縣將50頭藏豬(雌、雄各半)引種到廣州,首次開展對藏豬進行實驗動物化的培育,并將其命名為西藏小型豬(Tibet m ini-p ig),2006底獲得廣東省實驗用西藏小型豬生產質量合格證。本項研究的目的就是在對線粒體控制區研究的基礎上,分析西藏小型豬Cyt b基因的堿基序列,研究西藏小型豬Cyt b基因序列與線粒體控制區序列的變異是否存在相關性,以及西藏小型豬的遺傳分化以及與其他小型豬的親緣關系,對小型豬新品系的培育具有重要的理論指導意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

由南方醫科大學實驗動物中心提供西藏小型豬DNA樣品23份(代表m tDNA D-loop5′端序列的主要單倍型個體),巴馬小型豬、貴州香豬和五指山豬的DNA樣品[7]。另外從GenBank下載的13種國內外的代表豬的m tDNA Cytb基因堿基序列用于比對研究。具體品種和GenBank登錄號為:歐洲豬(AJ002189)、杜洛克(Duroc-AY830186)、JNP1-AY830173、S WB1-AY237510、 IB1-AY237484、漢普夏(Hampshire–AY 830187)、PAuk01 New Zealand-DQ444707、瑞典野豬(Swedish w ild boar-AF304 203)、Landerace-AF486866、大白豬(LW 2-AF136548)、榮昌豬(Rongchang–AF486860)、香豬(X iang-AF486859)及梅山豬(M eishan-AF304200)。

1.2 Cyt b基因序列擴增和分析

參照文獻[8]設計特異引物,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成引物:Cyt b gene 14109到15355(forw ard:5′-CACGACCAATGACATGAAAAATC-3′,and reverse:5′-TGGCCC-TCCTT TTCTGGTTTA-3′)。產物擴增采用一管便捷式PCR試劑盒:2×Pfu PCR M aste rM ix進行目的產物的擴增。

反應體系50μL,包括DNA模板2μg、P1和P2分別為(10μmol/L)2μL、2×Pfu M aste rM ix 25 μL、ddH2O 19μL。擴增程序:預變性94℃5 m in; 94℃45 s,55℃45 s和72℃1 m in,35循環;72℃延伸7 m in后4℃保存。產物進行電泳觀察。擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序,結合C lustalw軟件和M EGA 3.0軟件進行所測序列比對,并經人工核查,確定變異位點,建立西藏小型豬和國內其他豬的親緣關系樹。

2 結果

2.1 西藏小型豬Cyt b堿基全序列比對

西藏小型豬和其他三種小型豬Cyt b基因序列擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果,見圖1。以擴增用引物作為測序引物,測定2個反應結果,拼接后得到擴增片段的全序列大約1247 bp,去掉兩翼的107 bp序列后得到完整的1140 bp Cytb基因序列。西藏小型豬Cyt b序列和其他豬一樣全長為1140 bp,西藏小型豬Cyt b基因的堿基組成G+C含量為42%,A+T含量為58%;有9個變異位點,核苷酸多樣性為0.078 9。A型和B型西藏小型豬的堿基組成差異無統計學意義。

圖1 西藏小型豬、巴馬小型豬、五指山豬和貴州香豬Cyt b基因瓊脂糖凝膠電泳圖F ig.1 Agarose gel m app ing of Cyt b gene in the m ini-p igs.

2.2 西藏小型豬和國內家豬與歐洲豬Cyt b堿基序列比對

多序列比對分析顯示,西藏小型豬與國內家豬的序列變異位點少,與榮昌豬相比,西藏小型豬的Cyt b堿基序列有6種單倍型(T M 01、04、17、28、43、45);巴馬小型豬有3種單倍型(b14、15、16);貴州香豬有1種單倍型(g14);五指山豬有2種單倍型(w zs01、11)。這4種小型豬之間都有共享單倍型。歐洲豬Cyt b堿基序列比較,9個歐洲品種豬有5個變異位點,而國內家豬與歐洲豬的差異較大,見表1。

表1 西藏小型豬和其他豬Cyt b基因序列比對Tab.1 Variab le nucleotide sites of Cyt b gene of the four breeds of the m ini-p igs

西藏小型豬有14個位點與國內家豬相同而與歐洲豬不同,而且全部為轉換位點,未見顛換或缺失、插入現象。另外與國內家豬相比,在420位點存在T→C轉換,同時在883位點存在G→A轉換,見表1。以歐洲豬作外圍以Cyt b序列建立的親緣關系樹顯示,國內家豬與歐洲豬完全分開,如圖2所示,西藏小型豬也被分為兩個部分。

3 討論

T M、T MP:西藏小型豬;b:巴馬小型豬;g:貴州香豬;wzs:五指山豬。歐洲豬(A 002189J)作為外圍。圖2 西藏小型豬和國內家豬與歐洲豬的親緣關系樹Note:T M,T M P:Tibet m ini-p ig;b:Bam a m iniature p ig;g: Guizhou xiang p ig;W uzhishan p ig.European p ig(AJ002189)as outgroup.F ig.2 The phylogenetic tree of the Tibetm ini-p igs, other Chinese p igs and European p igs.

通過對西藏小型豬m tDNA控制區序列研究,根據串聯重復區10bp的重復片段及其排列,我們將重復片段完全一樣的個體為A型,其余部分的個體為B型。同時,控制區(D-loop區)5′端有20個變異位點,包括轉換和顛換,其中以三個轉換位點較突出,即305位點t→c轉換、500位點a→g轉換、691位點a→g轉換。A型和B型的變異,與5′端三個主要變異位點幾乎是相對應的[7]。本實驗主要以代表控制區5′端序列單倍型的西藏小型豬個體以及巴馬小型豬、貴州香豬和五指山豬的部分單倍型個體的基因組DNA,擴增Cyt b基因序列與基因庫中公布的部分國內家豬和歐洲豬序列比對發現,國內豬的Cyt b基因序列間的同源性較高;與歐洲豬的差異較大,至少有14個位點完全不同(轉換位點)。從血緣關系樹也可以看出國內家豬與歐洲豬的血緣關系較遠,此一結果與許多文獻結果一致[9-15]。在所測的23個西藏小型豬的序列當中,有兩個特殊位點即在420位點T→C轉換(11/23)的同時,在883位點存在G→A轉換(12/23),這也是在親緣關系樹中相對分為兩部分的主要因素。說明西藏小型豬的Cyt b基因序列也存在分化,由此說明線粒體控制區的分化,包括串聯重復區的排列變化、5′端堿基序列的位點轉換可能與Cyt b的分化存在很大相關性。這些分化變異是否對動物的生理生化指標產生影響還需要進一步比較研究。

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Com par ison of the Cy t b Gene Sequences in T ibetM in i-Pig and O ther Ch inese Pigs

L IHong-tao1,X IAO Dong2,GU W ei-wang2＊,WU Q ing-hong2, YUAN Jin2,WANGW an-shan2,ZHANG Jia-ning2
(1.FirstA ffiliated Hosp ital of GuangzhouM edicalUniversity,Guangzhou 510120,China;
2.Laboratory Anim al Center,SouthernM edicalUniversity,Guangzhou 510515,China)

O b jective To analyze the Cyt b gene sequences in Tibet m ini-p igs and clarify the differences and genetic relationship w ith other Chinese p igs.M ethod The sequence of Cyt b gene w as amp lified from genome DNA of Tibetm ini-p ig,Bam a m iniature p igs,Guizhou xiang p igs and W uzhishan(W ZS)p igs.A fter sequencing,the base sequences were compared and analysed.The b lood relationship tree and evo lution position of Tibet m ini-p ig were established.Resu lt There were 14 m utation sites between dom estic p igs in China and p igs from Europe.Besides there was a significant difference in two nuc leo tide site:a T→C sw itch in site 420 and the G→A s w itch in site 883 at the sam e tim e.Conc lusion Chinese p igs include Bam a m iniature p igs,Guizhou xiang p igs andW ZS p igs,have a very close b lood relationship w ith som e of Tibetm ini-p igs.It has been confirm ed that there is a certain genetic d ifferentiation in the Tibet m ini-p ig.

Tibetm ini-p ig;Cyt b gene;Comparative research

R332

A

1005-4847(2010)01-0044-04

2009-06-04

廣東省科研計劃項目(編號:2006B60101059,2007B020706002)。

李洪濤(1964-),男,研究方向:比較醫學。E-mail:Hongtao@zzu.edu.cn

顧為望。E-m ail:Guww100@163.com