非小細胞肺癌細胞株TGFBR3基因缺陷表達及其分子機制研究

蔣謝芳 劉仍允 雷哲 尤嘉琮 周清華 張洪濤

目前所知不少生長因子、調節肽及其受體參與了癌癥進程的調控。TGF-β信號轉導通路蛋白的變異與腫瘤的關系是現今研究的熱點之一。在腫瘤發生進程中TGF-β信號通路常表現出二元性[1]。腫瘤發生早期TGF-β可能作為腫瘤抑制因子，通過誘導細胞程序性死亡和細胞周期停滯從而抑制上皮細胞生長，但腫瘤惡化后TGF-β高表達，腫瘤細胞失去了對TGF-β信號的應答能力，腫瘤細胞自分泌的TGF-β通過增加透明質酸酶、纖維素酶的活性，引起基膜降解，提高腫瘤運行能力，促進腫瘤細胞轉移，同時抑制周圍正常細胞的增殖，影響淋巴細胞對腫瘤細胞的免疫作用，從而為自身癌細胞的生長篩選一個良好的內環境，發揮著促癌效應[2]。TGF-β信號通路通過調控血管發生、細胞增殖和分化，在肺癌發生發展過程中發揮著重要作用，大多數肺癌對TGF-β介導的抑制效應有耐受性，但其機制尚不清楚。TGF-β信號通路中的一種組分包括TGFBR2、smad2、smad4等的變異或缺失先前曾有研究[3]報道，然而這類變異在非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）中并不常見。Smad2和Smad4在肺癌中的變異只有5%-10%，大多數NSCLC中TGFBR1和TGFBR2均有表達[4-6]，而作為TGF-β信號通路中輔助受體的TGFBR3基因在NSCLC組織中常發生mRNA和蛋白水平上的表達缺失或下調[7]。

TGFBR3基因有兩個選擇性的啟動子區（定義為proximal promoter和distal promoter）[8]，蛋白產物由851個氨基酸構成，是細胞內含量最豐富的一種類型蛋白多糖，又稱betaglycan。它的表達與癌癥的關系非常密切，在多種腫瘤中均有抑制癌細胞轉移和侵襲作用，可調控多種腫瘤的進程[9-11]。TGFBR3在金屬蛋白酶作用下進行溶蛋白性裂解，胞外功能區脫落后產生的可溶性sTGFBR3可以競爭性結合腫瘤自分泌的TGF-β，通過阻斷TGF-β促癌效應來抑制人類腫瘤的惡化[12]。作為TGF-β對抗物，TGFBR3對于抑制腫瘤惡化具有潛在的治療學意義。近幾年來，研究者發現在許多腫瘤中存在TGFBR3的表達缺失情況，且表達降低或缺失與腫瘤的惡化程度相關。然而對TGFBR3表達缺失的研究并不全面，Finger等[7]研究發現在NSCLC中雜合子丟失可能是TGFBR3表達下調中的一種機制，但僅雜合子丟失未能完全闡明TGFBR3的表達缺失機制。已有報道[10,11]指出在卵巢癌癌和前列腺癌腫中TGFBR3的表達可能受表觀遺傳調控，盡管如此，在NSCLC中TGFBR3基因啟動子序列的CpG位點甲基化作用機制是否與TGFBR3的表達有關尚未見報道。我們推測TGFBR3基因的失活機理除基因缺失（雜合子丟失）和突變外，啟動子區域的CpG島甲基化也可能是該基因表達異常或失活的分子機制。在本實驗研究中，我們利用Western blot檢測TGFBR3在不同類型NSCLC細胞株和正常支氣管上皮細胞中的表達情況，采用修飾DNA直接測序（bisulfite modification sequencing,BSP）對TGFBR3啟動子區的CpG位點的甲基化狀態進行分析，探討TGFBR3基因表達失活的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 NSCLC細胞系（A549、LTEP-a-2、SKMES-1、95D、SPC-A1、NCI-H460）購自中國科學院上海細胞所，正常支氣管上皮細胞（human bronchial epithelial cell, HBEpiC）購自美國ATCC公司。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640培養基為美國GIBCO公司產品，兔抗人TGFBR3多克隆抗體購自美國Abcam公司，小鼠抗人β-actin抗體及辣根過氧化物酶標記羊抗兔和羊抗鼠二抗均購自武漢博士德公司，CpGenomeTMFast DNA Modification Kit購自Chemico公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 采用10%的胎牛血清及含青、鏈霉素的RPMI-1640培養基培養A549、LTEP-a-2、SK-MES-1、95D、SPC-A1及NCI-H460細胞，HBEpiC應用推薦的培養基BECM進行培養，所有細胞置于37oC含5%CO2、95%空氣的恒定濕度的細胞培養箱內進行培養。

1.2.2 Western blot實驗 RIPA裂解液裂解細胞，低溫高速離心（4oC, 10 000 g）5 min后收集清液。BCA法測蛋白濃度，計算各樣品蛋白濃度。每個細胞樣取總蛋白50 μg，8%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉印至PVDF膜（200 mA, 2 h），5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗（兔抗人TGFBR3多克隆抗體，工作濃度1:1 000）、內參（β-actin抗體，1:1 000），4oC孵育過夜。之后加1:40 000稀釋的HRP標記的羊抗兔二抗37oC孵育2 h。ECL試劑盒發光，暗室曝光膠片，掃描并分析條帶的光密度值，應用SigmaScan Pro 5圖像分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數字化。TGFBR3蛋白的灰度值除以內參基因產物β-actin蛋白的灰度值以校正誤差，所得比值結果代表樣品的TGFBR3蛋白相對含量，重復3次獨立試驗，取平均值。

1.2.3 基因突變檢測

1.2.3.1 基因組DNA制備 參照QIAGEN DNeasy Tissue kit說明書提取細胞基因組DNA，紫外分光光度計鑒定，吸光度OD260/OD280≈1.8。

1.2.3.2 PCR擴增 基因組DNA用于檢測近端啟動子區基本轉錄元件（-165到-75）的突變情況，上游引物：5′-CAC AGGCTCGAGCAGCATTC-3′，下游引物：5′-ATTACCCC CATCAGGCCGAC-3′。PCR反應體系為50 μL，50 ng-100 ng基因組DNA，1 unit Ex Taq DNA polymerase（Takara,Japan），0.2 μmol/L的上下游引物，1×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus），0.25 mol/L的dNTPs，加滅菌去離子水至50 μL。PCR反應參數：95oC預變性5 min；94oC變性30 s，61oC退火40 s，72oC延伸40 s為一個循環，共30次循環；最后一個循環后再72oC延伸10 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，純化并測序（北京華大基因研究中心測序）。

1.2.4 TGFBR3基因啟動子區轉錄起始點上游序列分析 使用MethPrimer軟件分析TGFBR3基因proximal promoter和distal promoter轉錄起始點上游約1 000 bp的核酸序列，預測TGFBR3基本轉錄元件所在區域CpG島，并完成BSP（bisulfite sequence-PCR）的引物設計。

1.2.5 重亞硫酸氫鹽修飾及BSP檢測 基因組DNA在進行甲基化分析前先用重硫酸氫鈉鹽進行修飾，修飾方法見CpGenomeTMDNA快速修飾試劑盒。簡略概述如下：將1.0 μg的DNA溶于100 μL的雙蒸水中，加入7 μL新配制的3 mol/L的NaOH溶液，于37oC變性10 min。然后加入550 μL新配制的DNA修飾劑（pH5.0），混勻。將混合物于55oC水浴20 h。加入750 μL的結合緩沖液后，用離心吸附柱純化修飾后的DNA，然后加入50 μL 120 mmol/L NaOH/90%EtOH進行脫硫。最后，將DNA用30 μL-45 μL洗提緩沖液溶解，貯存于-20oC備用。取1 μL修飾后DNA作為模板，使用BSP引物（表1）擴增，PCR循環條件為：95oC預變性5 min，94oC、30 s，多種退火溫度45 s，72oC延伸1 min、15 s，35個循環，最后一個循環72oC延伸10 min。BSP產物電泳割膠回收純化后送北京華大基因研究中心測序。

1.3 統計學處理 TGFBR3蛋白表達相對定量以β-actin作為內參照進行定量標定，應用TGFBR3與β-actin蛋白灰度值的比值作為相對表達量。數據以Mean±SD表示，7株細胞間TGFBR3的相對表達量的總體差異性比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），TGFBR3相對表達量在任意兩株細胞間是否存在差異采用bonferroni檢驗。所有統計分析均使用SPSS 16.0統計軟件進行運算，所有檢驗均為雙側檢驗，且以P＜0.05為具有統計學差異。

2 結果

2.1 TGFBR3在NSCLC細胞株和HBEpiC細胞中的表達TGFBR3在6株NSCLC細胞和HBEpiC細胞中均有表達（圖1A），圖1B中展示了蛋白條帶相對定量分析結果，以TGFBR3與β-actin蛋白灰度值的比值作為相對表達量。TGFBR3在7株細胞中的表達情況如表2所示。以HBEpiC細胞中TGFBR3蛋白表達作為陽性對照，其蛋白表達相對量為0.48±0.02，而在6株NSCLC細胞株中TGFBR3蛋白的表達明顯降低，分別為：SPC-A-1為0.11±0.02，LTEP-α-2為0.15±0.02，A549為0.14±0.01，NCI-H460為0.14±0.01，SK-MES-1為0.11±0.02，95D為0.08±0.01。6株NSCLC細胞與HBEpic細胞相比均存在統計學差異（P＜0.001），另外6株NSCLC細胞株中高轉移株95D細胞與LTEP-α-2、A549、NCI-H460細胞相比TGFBR3蛋白表達也存在統計學差異（P值分別為0.003、0.017、0.011）（表2）。

表 1 TGFBR3基因BSP引物Tab 1 BSP primers used for TGFBR3 gene

表 2 TGFBR 3蛋白與β-actin在HBEpiC和6株NSCLC細胞株中的表達（Mean±SD）Tab 2 Expression levels of TGFBR3 and β-actin in HBEpiC and 6 NSCLC cell lines (Mean±SD)

圖 1 Western blot檢測TGFBR3在NSCLC細胞及HBEpiC細胞中的表達情況。β-actin為內參照（A），及蛋白表達的相對定量結果（B）。Fig 1 Expression levels of TGFBR3 were measured by Western blot in NSCLC cell lines and HBEpiC. A, β-actin used as an internal control; B, relative estimate for expression of TGFBR3.

2.2 DNA序列分析 對6株NSCLC細胞株及HBEpiC proximal promoter區基本轉錄元件區（-165到-75）進行DNA測序發現7個樣本DNA序列均無遺傳突變。核酸序列（圖2）與Genbank中TGFBR3基因（GeneID: 7049）序列一致。

2.3 TGFBR3基因啟動子區域序列特征及BSP測序結果MethPrimer軟件分析顯示TGFBR3基因兩啟動子區轉錄起始點上游CpG含量豐富，均存在CpG島（圖3，圖4）。Hempel等[9,10]在卵巢癌（Ovca420）和乳腺癌（MDAMB-231）細胞株中應用熒光素酶報告分析法研究啟動子活性發現TGFBR3基因proximal promoter中近轉錄起始點區域-165到-75處為活性最強的單位，另外在distal promoter中發現-314 bp到-199 bp區域表現為轉錄抑制作用。故此我們選取了TGFBR3基因-165到-75和-500 bp到-314 bp之間序列為檢測區域。所研究的區域中轉錄起始位點上游-75到-165處共計出現13個CpG位點，分布在-82、-84、-88、-94、-103、-118、-120、-122、-134、-142、-145、-154、-164處，-314 bp到-199 bp區域我們檢測8個CpG位點，分布在-292、-290、-286、-277、-270、-218、-214、-202處。BSP測序結果顯示HBEpiC和6株NSCLC細胞株-165到-75區域13個CpG位點都未被甲基化（圖5），-314 bp到-199 bp區域8個位點均完全甲基化（圖6）。

3 討論

圖 2 TGFBR3近端啟動子區基本轉錄元件區（-165到-75）DNA測序結果Fig 2 Schematic representative of DNA sequencing for the proximal promoter region from site -165 to -75 of TGFBR3 gene

圖 3 TGFBR3基因proximal promoter近轉錄起始位點處（-165到-75）CpG島。TSS：轉錄起始位點。Fig 3 A scheme of CpG islands covering the upstream sites from -165 to -75 of TGFBR3 gene proximal promoter. TSS: transcription start site.

圖 4 TGFBR3基因distal promoter區近轉錄起始位點處（-314到-199）CpG島。TSS：代表轉錄起始位點。Fig 4 A scheme of CpG islands covering the upstream sites -314 to -199 of TGFBR3 gene distal promoter. TSS: transcription start site.

TGF-β是一類多功能的多肽類生長因子，在調控細胞內環境穩定、胚胎發育、細胞增殖、分化、轉移、凋亡和免疫監控過程中發揮重要作用，與人類多種疾病尤其是腫瘤的發生發展密切相關。它通過與其表面特異性受體結合組成TGF-β信號通路發揮細胞學效應。目前發現3種TGF-β特異性受體：I型（TGFBR1）、II型（TGFBR2）和III型（TGFBR3），其中I、II型受體是信息傳遞分子，介導TGF-β信號通路發揮細胞學效應，III型受體不同于I、II型受體，它沒有激酶功能域，未發現其直接參與信息傳遞，在功能上具有二元性[13]：一方面為TGF-β的一種特異性輔助受體，促進TGF-β信號通路的進行；另一方面作為抑癌基因，在多種腫瘤中能抑制腫瘤細胞的侵襲、轉移和血管發生作用，負性調控癌癥進程。

圖 5 TGFBR3基因proximal promoter近轉錄起始位點處（-165到-75）BSP測序結果。紅色箭頭代表未甲基化CpG位點。Fig 5 Schematic representative of BSP sequencing for the proximal promoter region from site -165 to -75 of TGFBR3 gene. Red arrow,unmethylated CpG sites.

圖 6 TGFBR3基因distal promoter區近轉錄起始位點處（-314到-199）BSP測序結果。藍色箭頭代表CpG甲基化位點。Fig 6 Schematic representative for BSP sequencing for the proximal promoter region from site -314 to -199 of TGFBR3 gene. Blue arrow,methylated CpG sites.

大量證據顯示TGFBR3作為抑癌基因，在許多人類癌癥中存在表達缺失或降低情況。與TGF-β信號通路其它組分相比，TGFBR3的表達降低或缺失是一個更為頻繁的事件[15-17]。TGFBR3的表達降低常伴隨著成神經細胞瘤[17]、卵巢癌[10,18]、卵巢粒層細胞瘤[19]、子宮內膜癌[20]、前列腺癌[11,14]、腎細胞癌[21]、乳腺癌[9]及胰腺癌[16,22]等腫瘤惡化程度的增加。本研究檢測到與正常支氣管上皮細胞相比，NSCLC細胞系中TGFBR3蛋白表達明顯下凋，這與Finger等[7]在NSCLC組織中檢測到的結果類似，表明TGFBR3對NSCLC的發生發展起到重要的作用。另外，6株NSCLC細胞株中，高轉移株NSCLC細胞95D與其它3種非轉移NSCLC細胞（LTEP-α-2、A549、NCI-H460）相比，TGFBR3蛋白表達水平顯著降低，提示在NSCLC中TGFBR3與細胞轉移潛能相關，TGFBR3可能影響腫瘤細胞的侵襲和轉移作用。研究結果從細胞水平上進一步證實了TGFBR3的表達下調或缺失與NSCLC癌癥進程呈負性相關。

關于腫瘤進程中TGFBR3的表達下調或缺失的機制目前存在若干種解釋。TGFBR3基因位于染色體1p33-p32區域內，這個區域在許多人類腫瘤包括乳腺癌、胃癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、肺癌、卵巢癌中頻繁缺失[23]。在乳腺癌、前列腺癌、NSCLC和肝癌中發現20%-50%患者TGFBR3基因發生雜合性丟失（loss of heterozygosity, LOH）[9,11,13,16]，但在多數腫瘤樣本中，TGFBR3的低表達或缺失并不與LOH相匹配，提示存在其它機制負性調控TGFBR3的表達。TGFBR3基因proximal promoter中近轉錄起始點區域-165到-75區為活性最強的單位，該區域包含SP1結合位點，該片段的缺失或變異會導致TGFBR3表達水平的明顯下降，鑒于此，我們對該區域進行了突變檢測，結果顯示6株NSCLC和HBEpiC中均無任何堿基突變，這與Bae等[15]在肝癌樣本中的研究結果相類似。此外，有個別研究[24]報道了TGFBR3基因5′UTR區、3′UTR區和ORF區的存在單核苷酸多肽性（single nucleotide polymorphism, SNP），但并未發現這些SNP具有生物學效應。Hempel等[8]在卵巢癌細胞株中發現使用甲基轉移酶抑制劑和組蛋白去乙酰化酶抑制劑（TSA）處理能提高TGFBR3基因mRNA水平上的表達，提示在此類腫瘤中表觀遺傳調控機制可能是導致其表達水平下降的潛在機制。然而，關于TGFBR3基因異常表達的表觀遺傳調控機制尚未得到深入研究。

抑癌基因的失活通常由遺傳和表觀遺傳機制造成，遺傳缺失和點突變能使基因表達異常，而表觀遺傳修飾也可能導致基因表達異常。人類DNA的表觀遺傳修飾的主要形式是甲基化修飾，并且許多抑癌基因原本非甲基化的CpG島的超甲基化與基因的表達失活相關。目前國內外對TGFBR3缺失機制的研究較少，而關于其CpG島甲基化狀態和基因表達水平與NSCLC發生的關系迄今為止還未在表觀遺傳調節方面做闡述。為了在NSCLC細胞中闡明可能會影響TGFBR3表達的表觀遺傳機制，我們分析研究了TGFBR3基因的甲基化情況，選取該基因proximal promoter和distal promoter序列進行了生物信息學分析。

分析結果顯示，這兩個啟動子區序列均存在CpG島，有高甲基化或低甲基化的基礎。且Hempel等研究提示DNA甲基化修飾很可能參與了該基因的表達調控，作為基本轉錄元件的proximal promoter-165到-75區和作為重要轉錄抑制元件的distal promoter-314到-199區的甲基化狀態可能會與TGFBR3表達相關。本實驗應用BSP法對TGFBR3基因的預測啟動子序列進行甲基化分析。測序結果顯示，正常表達TGFBR3基因的HBEpiC及表達下調的NSCLC細胞株其啟動子區-165到-75序列均無甲基化，研究結果提示，TGFBR3基因啟動子區重要轉錄元件-165到-75區域的甲基化發生狀態并不是TGFBR3基因表達下調的主要原因，但是在其它腫瘤細胞中還沒有此類報道，我們不排除在其它腫瘤中該部位發生甲基化的可能性。Distal promoter-314到-190區8個CpG位點在所有細胞株中都完全甲基化，表明該區域的甲基化狀態與TGFBR3表達缺陷并無相關性。另外我們在隨機抽取的幾例NSCLC組織及相應癌旁組織樣本中發現了同樣的情況。我們的研究結果提示TGFBR3基因啟動子區重要轉錄元件的甲基化異常現象可能在NSCLC發生發展過程中并不是一個常見事件。關于TGFBR3基因失活的原因還需進一步探討。然而，我們的研究為全面闡述NSCLC的DNA甲基化譜提供了研究數據。