胡蘿卜花粉離體萌發(fā)研究

宋紅霞，劉艷麗，武 喆，張光星

（山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西太谷030801）

胡蘿卜為復傘形花序，一個總花序有8～12層，在不整枝的情況下，一般由90～110個小花序組成，單個花器官比較小[1]。它主要利用雄性不育進行制種，因此育種研究工作中常存在父母本花期一致與否的問題，也常因花期低溫、陰雨等不良氣候條件影響正常授粉而降低結(jié)籽率。為了解決這些問題，生產(chǎn)上常采用人工輔助授粉，而在人工授粉之前，通常要對花粉的生活力進行測定。

本試驗在前人研究基礎上，采用離體萌發(fā)法檢測胡蘿卜的花粉活力，以期篩選并優(yōu)化出最佳的胡蘿卜花粉活力萌發(fā)配方。

1 材料和方法

1.1 材料

供試胡蘿卜品種為山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院培育的甜紅1號的父本。

1.2 方法

分2個步驟進行試驗：第一步，培養(yǎng)基篩選，以離子水為對照，設置了8個配方，即A.蔗糖100 g/L+ 硼 酸 300 mg/L；B.BK 100 mg/L；C.BK 100 mg/L+ 蔗糖 100 g/L；D.PEG（分子量為 6 000）200 g/L；E.PEG 200 g/L+ 硼酸 300 mg/L；F.PEG 200 g/L+蔗糖 100 g/L+硼酸 300 mg/L；G.PEG 200 g/L+BK 100 mg/L；H.PEG 200 g/L+ 蔗糖 100 g/L+BK 100 mg/L。其中，BK成分為硼酸 300 mg/L，Ca（NO3）2·4H2O 300 mg/L，MgSO4·7H2O 200 mg/L，KNO3100 mg/L。第二步，在篩選出配方的基礎上進行優(yōu)化，對 PEG、硼酸、Ca（NO3）2·4H2O 3 個因素各設 6 個水平，PEG：50，100，150，200，250，300 g/L；硼酸：100，200，300，400，500，600 mg/L；Ca（NO3）2·4H2O：100，200，300，400，500，600 mg/L。

花粉采集：選擇當天開花的花盤，將花粉采集在事先鋪好硫酸試紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋好蓋子帶回實驗室室溫保存。

用品消毒：試驗所用器具都要在消毒柜中消毒或在100℃條件下消毒20 min，冷卻后取出用酒精棉球擦干放在大培養(yǎng)皿中備用。經(jīng)過消毒過的載玻片在使用時要盡量減少與手指接觸的面積，以減少污染。

花粉的播種與活力檢測[2]：均在花粉采集當天進行。用滴管吸取液體培養(yǎng)基滴2～3滴于凹面載玻片上，用經(jīng)酒精消毒過的頭發(fā)絲蘸取少量花粉，并將其散于培養(yǎng)基表面，注意花粉分布要松散均勻（一般情況下，一個顯微鏡視野以分布100～200?；ǚ哿橐耍?。然后將載玻片放置于培養(yǎng)皿中，要在皿內(nèi)事先放好濾紙并加水保濕，用紗布覆蓋后加蓋，標記，放于25℃恒溫箱內(nèi)進行暗培養(yǎng)，1 h后在顯微鏡下觀察，選擇3個不同視野，3次重復，計算花粉活力。

花粉活力（%）=花粉萌發(fā)粒數(shù)/總花粉粒數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的篩選

通過對不同配方培養(yǎng)基的胡蘿卜花粉活力檢測得出，A，B，C配方均為噴發(fā)內(nèi)含物，無花粉管萌發(fā)（圖1）；D，E配方的表現(xiàn)為極個別萌發(fā)（圖2），不適合檢測胡蘿卜花粉活力；F，G，H配方的表現(xiàn)為萌發(fā)較多（圖3），可用于檢測花粉活力。

將 A，B，C配方分別與 F，G，H 配方進行比較，未添加PEG的培養(yǎng)基無萌發(fā)，添加PEG的培養(yǎng)基有萌發(fā)，則說明PEG對胡蘿卜花粉萌發(fā)起重要作用，這與周莉花[3]、宋紅霞[4]的研究結(jié)果一致；將D，E，F(xiàn)配方進行比較得出，蔗糖對花粉萌發(fā)有促進作用。

表1是2009年5月12—16日采集當天花粉計算得到萌發(fā)率。從表1可以看出，無論哪一天的檢測結(jié)果，均為G配方的萌發(fā)率高于F，H配方，比較F和H配方得出，添加BK比添加單一硼酸能顯著促進花粉萌發(fā)；H配方比G配方添加了一定量的蔗糖（100 g/L），花粉萌發(fā)率卻較低，這可能是蔗糖與PEG互作抑制了花粉的萌發(fā)。本試驗條件下，G配方最適于檢測胡蘿卜花粉活力。

表1 F，G，H配方萌發(fā)率比較 %

2.2 篩選出的配方優(yōu)化

PEG是一種高分子滲透劑，能使花粉內(nèi)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，改變膜表面的電荷，使膜的柔軟程度和通透性提高，從而促進花粉萌發(fā)和花粉管的生長[5]。在G配方的基礎上，改變PEG的濃度，觀察胡蘿卜花粉萌發(fā)情況（表2）可知，隨著PEG濃度的升高，萌發(fā)率增加，PEG達到100 g/L時，萌發(fā)率達到最大值；再增加PEG的含量，萌發(fā)率卻呈下降趨勢，這表明PEG濃度過高或過低都不利于胡蘿卜花粉萌發(fā)，100 g/L濃度的PEG是促進胡蘿卜花粉萌發(fā)的最佳濃度。

表2 PEG對花粉萌發(fā)影響的多重比較

硼酸可增加氧的吸收并促進糖的吸收和代謝，有利于果膠的合成，因而對花粉的萌發(fā)和花粉管的生長起促進作用[6，7]。對BK培養(yǎng)基中硼酸的含量進行水平設置，觀察對花粉萌發(fā)的影響（表3）。從表3可看出，在硼酸低濃度區(qū)域，隨著硼酸濃度的增加，花粉的萌發(fā)率隨之增加；當硼酸濃度增加到300 mg/L時，花粉的萌發(fā)率達到了最大值，為52.28%；此后，隨著培養(yǎng)基中硼酸濃度的增加，花粉萌發(fā)率反而下降。對于本試驗而言，300 mg/L是硼酸促進胡蘿卜花粉萌發(fā)的最佳濃度。

表3 硼酸對花粉萌發(fā)影響的多重比較

前人研究結(jié)果表明，花柱組織中存在著Ca2+濃度梯度，它是花粉萌發(fā)和花粉管生長的關(guān)鍵因子，也是指引花粉管生長的基本因素[8]。由表4可知，Ca2+濃度為300 mg/L時，萌發(fā)率最高，但不同濃度的Ca2+對胡蘿卜花粉萌發(fā)率的影響差異都不顯著，以后還需要設置更寬的濃度范圍研究Ca2+對花粉萌發(fā)的影響。

表4 Ca2+對花粉萌發(fā)影響的多重比較

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，只有添加PEG配方的胡蘿卜花粉才有萌發(fā)，說明PEG對胡蘿卜花粉的萌發(fā)具有決定性作用；設置不同濃度水平進行優(yōu)化得出，100 g/L對花粉萌發(fā)有顯著作用。硼酸、Ca2+對花粉萌發(fā)有促進作用，且過高或過低的濃度會抑制花粉萌發(fā)，最佳濃度均為300 mg/L，本試驗條件下，最佳培養(yǎng)基為：100g/LPEG+0.1g/LBK。

試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，天氣、花齡不同，花粉活力均有差異，以后仍需進一步探索采集花粉的最佳時間。另外，影響花粉萌發(fā)的因素很多，諸如不同分子量的PEG、激素和pH等，這些還有待于進一步研究。