癲癇患者血漿神經肽Y與免疫細胞的水平變化及其臨床意義

汪 純，戢翰升

癲癇是由于多種原因引起的大腦神經元異常過度放電，造成腦功能暫時性的障礙。盡管目前發病機制尚不明確，但有研究表明神經系統、內分泌系統及免疫系統都參與了癲癇的發生、發展[1，2]。目前對癲癇與三者關系的單方面研究較多，但將三者聯系起來去探討癲癇的發病機制的尚少，本文對癲癇患者不同時期外周血中免疫細胞和神經肽（NPY）的水平進行測定及比較，探討癲癇形成的神經-內分泌-免疫機制及其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 檢測對象 2007-06～2009-06在筆者所在醫院神經外科住院的36例顳葉癲癇患者，其中男18

例，女18例；年齡9～46歲，平均25.4歲；病程2～21

年，平均8.9年；近6個月發作頻率1～12次/月，平均5.9次/月。病例入選標準：①具有典型的顳葉癲癇發作的臨床表現；②24 h視頻腦電圖顯示前或前中顳癲癇樣放電；③MRI顯示顳葉內側病灶、海馬硬化。所有受檢對象均同時滿足以下條件：①入院前24 h內無癲癇發作；②非腫瘤及占位引起的癲癇；③無傳染病或炎癥性疾病；④無急性嚴重的神經疾病（腦梗死，腦出血，腦炎等）；⑤2周內未受過外傷及手術；⑥0.5年內未用過激素和免疫抑制劑；⑦無肝腎功能不全；⑧無腎上腺皮質或下丘腦垂體異常疾病；⑨無嚴重精神疾病；⑩非孕期及月經期婦女。

1.2 試劑和儀器 單克隆抗體抗CD3FITC、抗CD4PE、抗CD8PE、抗 CD19PE及 CD16+56PE均由美國 Becton Dickinson 公司生產，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+分別代表總 T、Ts、TH、NK 細胞。紅細胞裂解液由BD公司生產。FACSCalibur流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司產品，神經肽Y放免試劑盒為深圳晶美公司產品，全自動微粒子化學發光免疫分析系統為美國貝克曼庫爾特公司產品，全自動血球計數儀為美國庫爾特公司產品。

1.3 檢測方法 所有患者均在入院時、入院10 min內和24 h分別抽取靜脈血4 ml進行檢測,一部分通過全自動血液分析儀進行白細胞計數和分類；另一部分進行淋巴細胞亞群和神經肽Y檢測。外周血淋巴細胞亞群檢測：樣品測定管中各加100 μl肝素抗凝血，加入上述單抗20 μl，振蕩混勻，室溫避光20 min，染色；加入1.5 ml紅細胞裂解液，混勻后室溫避光放置10 min，破壞紅細胞；離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min，棄上清；每管加入2 ml PBS，混勻，1000 r/min 離心 5 min，棄上清；加 PBS 1 ml，混勻，2 h內檢測。以前向角散射光（FSC）為橫坐標，側向角散射光（SSC）為縱坐標，對淋巴細胞進行設門，吸獲10 000細胞用Cell Quest軟件進行檢測分析。神經肽Y測定：取2 ml靜脈血注入含10%EDTA二鈉30 μl和抑肽酶40 μl的試管中混勻，立即在4℃，3 000 r/min離心10 min分離血漿，置-40℃冰箱保存待檢。按試劑盒說明書進行并計數。

1.4 統計學處理 采用SPSS16.0軟件作數據處理，計量資料先求出均數±標準差，三組間比較采用單因素方差分析，NK細胞與神經肽水平之間采用相關分析。

表 1 癲癇患者不同時間點免疫細胞及神經肽Y水平（±s)

表 1 癲癇患者不同時間點免疫細胞及神經肽Y水平（±s)

與對照組相比，*P<0.05，與入院10 min內相比，▲P<0.05

細胞類型 入院時 入院10 min內 入院24 h白細胞（109/L） 5.93±1.19 8.69±1.71* 6.48±0.60淋巴細胞（109/L） 2.12±0.62 2.85±1.07* 2.40±0.71中性粒細胞（109/L） 3.20±0.82 4.15±1.32* 3.49±0.88嗜堿粒細胞（109/L） 0.02±0.004 0.04±0.01 0.03±0.01嗜酸粒細胞（109/L） 0.21±0.06 0.20±0.07 0.19±0.05單核細胞（109/L） 17.23±6.38 14.21±6.82 17.51±4.62 B 細胞（109/L） 9.75±3.45 8.90±3.15 10.24±3.97 CD3+（%） 65.87±4.38 62.20±5.10* 66.32±4.70 CD4+（%） 43.38±5.32 37.26±6.28* 44.41±6.67 CD8+（%） 23.17±5.05 28.49±5.41* 22.87±5.26 CD4+/CD8+ 1.96±0.89 1.53±1.01* 2.07±0.94 NK（%） 12.38±5.28 21.29±6.21* 13.45±6.32 NPY（ng/L） 210.46±43.85 321.35±52.94* 243.68±48.62▲

2 結果

免疫細胞及神經肽Y的測定結果見表1。癲癇患者入院10 min內與入院時相比較外周血中白細胞總數、中性粒細胞、淋巴細胞、CD8、NK細胞及神經肽 Y 的水平均明顯升高 （P<0.05），CD3、CD4、CD4/CD8明顯降低 （P<0.05），其中CD4細胞降低13%；入院后24 h上述變化與入院時相比較無顯著性差異（P>0.05），血漿神經肽Y與血漿NK細胞變化呈正相關（r=0.839，P<0.05）。

3 討論

自1977年Besedovsky提出 “免疫-神經-內分泌網絡”學說后，癲癇發病的網絡機制得到國內外學者廣泛重視并在探討癲癇發病機制方面進行了深入的研究[2]。癲癇患者體內神經系統、免疫系統、內分泌系統三大調節系統存在密切而復雜的相互關系。三大系統之間通過雙向調節作用維持機體正常的生理活動，所以無論哪個系統出現問題都可以影響整個系統的平衡，促進癲癇的發作。研究癲癇的神經免疫機制對臨床治療有重要的指導意義。本研究系通過探討顳葉癲癇患者發作后不同時間外周血免疫細胞和神經肽Y濃度的變化，從免疫調節分子水平和細胞免疫學水平上探討癲癇神經免疫學發病機制。

有研究表明藥物也可引起免疫細胞的變化，筆者采用患者入院時為對照進行研究，排除了藥物的影響，結果示入院后10 min內外周血白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、CD8、NK細胞明顯升高。CD3、CD4、CD4/CD8 明顯降低（P<0.05），單核細胞、嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞無顯著性差異（P>0.05），提示炎癥反應參與癲癇發作，癲癇發作可引起機體免疫細胞的改變，免疫調節網絡處于失衡狀態。NK細胞和中性粒細胞是早期抗感染的重要效應細胞，當癲癇病灶放電，擴散，通過神經-內分泌-免疫網絡系統造成神經內分泌系統功能改變，使NK細胞和中性粒細胞迅速從細胞池中釋放到外周血中。目前認為NK細胞具有免疫調節作用，它對淋巴細胞功能也有重要影響[3，4]。T淋巴細胞對機體所有體液免疫和細胞免疫類型均有重要的調節作用。CD3代表總T細胞水平，反映機體總的細胞免疫狀態；CD4協調B細胞分化產生抗體，CD3、CD4T淋巴細胞的減少必然導致免疫功能低下，CD4細胞的降低也證明在對炎癥的直接反應中CD4細胞并不起主導作用[5]。CD8又分為T抑制細胞或細胞毒T細胞，其通過自身及抑制因子在免疫反應中起負向作用，抑制CD4細胞和B細胞功能，從而抑制抗體形成及細胞免疫反應。CD4/CD8比值保持動態平衡，以維持機體細胞免疫功能的穩定，比值降低說明機體T細胞亞群失衡，提示機體免疫功能低下。有文獻報道，CD3、CD4的含量和CD4/CD8比值降低可刺激B淋巴細胞分泌抗體形成免疫復合物、激活補體，使機體致病[6]。本文結果示入院24 h后外周血中免疫細胞與入院時無顯著性差異，說明這種免疫細胞的變化并不持久，癲癇發作時不僅抽搐本身對機體有損害，免疫系統的異常對機體也有潛在損傷，提示在癲癇發作時不僅要控制發作癥狀，也需對免疫系統進行調節預防再次發作；同時通過檢測外周血中24 h后免疫細胞的變化，可以排除因腫瘤、感染、腦膜炎、缺血性疾病等引起的癲癇。癲癇發作時的應激狀態以及腦部潛在的結構和功能異常均可引起免疫系統的異常，因此患者外周血中T淋巴細胞亞群及NK細胞的變化只是機體癲癇發作時免疫狀態的一個側面反映。

NPY在腦中起著神經遞質和神經調質的作用，主要分布在大腦皮層、丘腦及腦干，尤以海馬濃度最高，而大腦邊緣系統海馬區與免疫系統關系最為密切，海馬神經元異常電活動是許多類型癲癇的始動因素[7]，故NPY與癲癇的關系日益受到重視。本文結果表明癲癇發作后血漿中NPY顯著增加，這與國內外研究結果一致[8，9]，但24 h后與入院時比較無顯著性差異。關于癲癇發作時NPY合成增加的機制目前尚不清楚，一般認為有以下幾方面：①腦源性因素：Reibel等[10]認為腦源性神經營養因子（BDNF）是NPY合成增加原因之一，它對人類癲癇發病的病理生理作用是通過改變NPY的表達及其免疫反應性而發揮作用的，此外興奮性谷氨酸神經傳遞能調節NPY的表達，γ-氨基丁酸（GABA）A受體γ亞單位反義寡核苷酸也能引起NPY表達增高[11]；②外周因素：李亞軍等[12]發現在大鼠電驚厥前后血漿中NPY和NE含量成正相關，NPY與去甲腎上腺素（NE）共同處于交感神經末梢，并常與NE一起釋放。癲癇發作時機體處于應激狀態，交感神經興奮性增強，去甲腎上腺素等釋放增多，故NPY釋放量增多并可能通過某種途徑釋放入血。此外在血小板中發現與NPY合成相關聯的信息RNA，表明血小板有合成NPY的能力。在病理狀態下，血小板被激活釋放NPY，可能作為血小板-血管間的一種傳遞，直接與其它血管活性物質協同作用發揮生物效應，引起癲癇發作后血中NPY含量增加。同時筆者發現NK細胞變化與NPY之間存在正相關性，隨著NPY濃度的增高免疫細胞也升高。癲癇發作引起中樞和外周神經內分泌系統的廣泛改變，通過海馬以及海馬以外部位使腦內NPY濃度升高，引起下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸、交感神經-腎上腺髓質軸（SAM）功能亢進。Wahleste等用NPY灌注清醒、自由活動鼠的室旁核和腦室，可使ACTH和糖皮質激素（GC）分泌增加。GC是一種公認的免疫抑制劑抑制淋巴細胞分裂增殖，引起免疫力低下；另外交感神經興奮后其末梢釋放的兒茶酚胺類物質，它通過與淋巴細胞膜表面上的受體介導調節淋巴細胞的功能。可見癲癇發作時海馬-NPY-垂體-腎上腺軸對機體的免疫功能起著調節作用。

綜上所述，癲癇患者存在免疫功能的低下，癲癇發作后血漿NPY含量明顯增加，NPY可能參與了免疫功能的調節。通過檢測不同時期外周血中免疫細胞和NPY的變化，可以排除因腫瘤、感染、腦膜炎、缺血性疾病等引起的癲癇，是一種簡單而重要的輔助診斷手段；同時在癲癇治療時應輔以免疫調節治療。

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