參附湯超微粉單次及多次給藥在大鼠體內的組織分布研究

鄭愛華 蔡光先 劉紅梅

1 實驗材料

1.1 藥品和試劑 一等人參、附子藥材均從湖南省藥材公司購置,由湖南省中藥超微工程技術研究中心鑒定符合《中國藥典》2005版“人參、附子”項下規定。并分別加工為傳統飲片、3種不同粒徑超微粉(超微粉 1粒徑 D90為 18.75μm、超微粉 2D90為 37.5μm、超微粉 3 D90為 75μm)。取參附湯傳統飲片飲片,用水煎煮 2次,過濾,濾液濃縮至相當生藥量為2.14 g/m l;取參附湯超微中藥各粒徑粉用水煎煮 2次,過濾,濾液濃縮至 1.07 g/ml,另取超微粉 3濾液,濃縮至 2.14 g/ml。參附湯傳統飲片推薦成人日用量為 15 g,參附湯超微粉推薦成人日用量為 7.5 g。

1.2 儀器 島津 LC-10A高效液相色譜儀(配有 SCL-10Avp輸液泵,SIL-10ADvp紫外檢測器,CTO-10Asvp柱溫箱),日本島津色譜工作站;TGL-16高速臺式離心機;HZS-H水浴振蕩器。

1.3 動物 SD大鼠,SPF級,由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供,實驗動物生產許可證號為SCXK(滬)2003-0002,實驗動物合格證號為 0029453。

2 方法

2.1 單次給藥后的組織分布 48只 SD大鼠,隨機分為參附湯超微粉 3組、參附湯傳統飲片組(每組下設A、B、C、D 4個亞組,每亞組 6只),雌雄各半,分別以 10.7 g/kg、21.4 g/kg灌胃。給藥前大鼠禁食過夜直至實驗結束,不禁水。各亞組大鼠分別在給藥后 1,3,5,7 h股動脈放血處死,取心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器,-20℃冷凍保存,分析時,解凍后濾紙吸干水分,稱重,按重量體積比(1∶5)加入 HCl1.0mmol/L,勻漿,3000 r/min離心 10min,取上清液置三角瓶中,用飽和 NaHCO3溶液調各個臟器的勻漿上清液 pH值至 8～9,置于冷凍干燥瓶中,進行冷干處理至完全干透。用乙酸乙酯分別提取肝臟(30ml×3)、腎臟(25ml×3)、脾臟(15m l×3)、心臟(20 ml×3)、肺(20ml×3)、腦(20m l×3),合并各組提取液,40℃減壓蒸干,將各個臟器樣品殘渣用甲醇溶解,肝臟 800μl,腎臟 600μl、脾臟 850μl、心臟 900 μl、肺 700μl、腦 500μl、3000 r/m in離心 5min,取上清液 30μl供 HPLC分析[14]。

2.2 多次給藥后的組織分布 48只 SD大鼠,隨機分為參附湯超微粉 3組、參附湯傳統飲片組(每組下設 A、B、C、D四個亞組,每亞組 6只),雌雄各半,分別以 10.7 g/kg、21.4 g/kg劑量灌胃。連續給藥90 d,末次給藥前大鼠禁食過夜直至試驗結束,不禁水。各亞組大鼠分別在給藥后 1,3,5,7 h股動脈放血處死,取心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器,所取組織及組織樣品的處理、分析同“2.1”項。

2.3 色譜條件 色譜柱 MN-Nucleosil7C6H 5不誘鋼柱(250 mm×4.0mm);流動相:甲醇:水:氯仿:三乙胺(70:30:1:0.2);流速:1.5 ml/min;檢測波長:235nm;檢測溫度:室溫。進樣量 20μl。進樣前考察研究方法的可靠性和穩定性,建立色譜圖、標準曲線,考察其回收率和精密度。

2.4 數據分析 采用中國藥理學會的 3P97實用藥代動力學計算程序計算處理,獲得各項組織分布參數;結果為計量資料,以±s表示,采用 SPSS11.0軟件包分析處理;方差齊時,采用方差分析(最小顯著差法,LSD),不齊,則采用近似方差分析(Tamhane′s T2)。

3 結果

3.1 大鼠單次與多次給藥后的組織分布 單次和多次(90 d)給藥后,不同時間點烏頭堿在各組織中的分布結果見表1、表 2。結果表明烏頭堿在肝臟的濃度最高,其次是腎臟和心臟;重復給藥 90 d后,各組織中的烏頭堿濃度均有增高。

表1 大鼠單次給參附湯后的組織分布(±s,n=6,μg/g)

表1 大鼠單次給參附湯后的組織分布(±s,n=6,μg/g)

組織 時間點(h)不同時間點烏頭堿在組織中的分布心肝脾肺腎腦超微飲片組 1 0.159±0.069 1.695±0.642 0.105±0.037 0.089±0.032 0.389±0.072 0.031±0.005 3 0.120±0.071 1.503±0.547 0.071±0.066 0.076±0.019 0.297±0.067 0.000±0.000 5 0.101±0.064 1.223±0.618 0.052±0.013 0.064±0.009 0.263±0.057 0.000±0.000 7 0.087±0.012 0.809±0.357 0.031±0.007 0.054±0.008 0.172±0.044 0.000±0.000傳統飲片組 1 0.162±0.031 1.714±0.702 0.113±0.037 0.091±0.034 0.405±0.037 0.033±0.006 3 0.122±0.035 1.601±0.691 0.074±0.041 0.073±0.015 0.306±0.050 0.000±0.000 5 0.102±0.042 1.263±0.531 0.054±0.009 0.065±0.010 0.274±0.061 0.000±0.000 7 0.082±0.027 0.810±0.079 0.033±0.006 0.059±0.009 0.135±0.030 0.000±0.000

表2 大鼠多次給參附湯后的組織分布(±s,n=6,μg/g)

表2 大鼠多次給參附湯后的組織分布(±s,n=6,μg/g)

組織 時間點(h)不同時間點烏頭堿在組織中的分布心肝脾肺腎腦超微飲片組 1 0.203±0.091 3.194±0.837 0.153±0.056 0.147±0.077 0.506±0.075 0.043±0.011 3 0.187±0.053 2.671±0.752 0.131±0.057 0.127±0.038 0.483±0.053 0.030±0.009 5 0.149±0.040 2.127±0.662 0.109±0.062 0.109±0.063 0.361±0.055 0.000±0.000 7 0.116±0.036 1.704±0.530 0.087±0.023 0.083±0.022 0.266±0.074 0.000±0.000傳統飲片組 1 0.211±0.038 3.322±0.917 0.160±0.032 0.157±0.042 0.513±0.047 0.037±0.010 3 0.191±0.052 2.816±0.617 0.134±0.073 0.130±0.030 0.497±0.084 0.000±0.000 5 0.135±0.042 2.226±0.597 0.095±0.050 0.102±0.075 0.371±0.057 0.000±0.000 7 0.112±0.057 1.713±0.604 0.076±0.061 0.091±0.017 0.262±0.039 0.000±0.000

4 討論

參附湯超微粉與參附湯傳統飲片經過重復給藥 90 d后,在大鼠體內的暴露量均有增加,藥物的清除能力均下降,表明參附湯在大鼠體內有蓄積現象。重復給藥后的組織分布實驗表明各組織中的參附湯濃度均有所升高,且肝、腎、心中藥物濃度升高的較多。組織分布試驗表明,烏頭堿在大鼠各臟器中的分布程度由大到小順序為:肝、腎、心、脾、肺,其中在肝臟中的分布量占絕對優勢,這也進一步說明了烏頭堿的體內代謝、排泄主要通過肝臟,其次為腎臟;烏頭堿在心、肺中的分布與其較強的抑制呼吸和致心律失常的中毒機理相關。

在腦中檢出的烏頭堿含量很低,3 h時后未能檢出烏頭堿,一方面說明檢測器的靈敏度不夠,另一方面也提示烏頭堿的主要作用部位不在中樞神經系統。