杜仲總黃酮對人肺腺癌細胞H1299細胞增殖的影響

鄧宏宇

（遵義醫學院中心實驗室 貴州遵義563000）

近年來，國內外許多學者對杜仲的化學成分和藥理作用進行了大量研究。研究證明,杜仲中含有黃酮類、環烯醚萜類、木脂類、三萜類、甾醇、糖類化合物和有機酸、醇、微量元素等多種功能成分[1]。其中，杜仲中黃酮類化合物的含量,是判斷杜仲生藥及其相關產品的重要指標。黃酮類化合物具有抑菌消炎、抗氧化、抗衰老、抗癌防癌等諸多功效[2]。

本實驗通過經醇提取的杜仲總黃酮成分對人肺腺癌細胞H1299細胞的作用,觀察杜仲總黃酮對H1299細胞增殖的影響，為杜仲抗腫瘤的藥效成分篩選以及杜仲的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑杜仲皮 采自貴州省正安縣城關鎮田生村，經遵義醫學院藥學系鑒定確認系杜仲皮。人肺腺癌細胞H1299：由生化教研室范芳副教授惠贈。DMEM培養基為Gibco公司產品;胎牛血清購自四季青生物公司;胰蛋白酶為國藥集團試劑有限公司產品;MTT為Sigma公司產品；蘆丁標準品購自北京中國藥品生物制品檢定所。

1.2 主要儀器 酶聯免疫檢測儀Bio-Tek instruments公司制造，超凈工作臺由蘇州凈化制造，二氧化碳培養箱由美國Thermo公司制造。

1.3 杜仲總黃酮的提取[3]杜仲皮制成粉狀,采用乙醇分段(60%~90%)提取法,醋酸鉛胺沉淀過濾,濃縮后過大孔樹脂、聚酰胺和硅膠柱，過柱樣品與標準品蘆丁對照,測得總黃酮含量為73%。用DMEM培養 液 制 備 總 黃 酮 濃 度 分 別 為 25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的藥液,調 pH 至 7.2~7.4 后過濾除菌。

1.4 H1299細胞的培養 復蘇液氮凍存的H1299細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，接種于細胞培養瓶中，置37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞到達對數生長期后，用于實驗。

1.5 MTT法檢測H1299細胞增殖抑制 將處于對數生長期的H1299細胞用0.25%的胰酶消化成單細胞懸液，調整濃度為2×104個/ml,接種于96孔板中,每孔200ul。培養24h后棄掉原培養液,分別加入杜仲總黃酮濃度為 25μg/ml 、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml培養液各200μl,另設一組只加培養液而不加黃酮為對照組,每組重復6孔。在加黃酮48h后,每孔加入5mg/ml的MTT 20μl,繼續培養4h后小心吸出培養液,每孔再加入150μl二甲基亞楓(DMSO)作用10min,酶聯免疫檢測儀上490nm波長測各孔吸光值,結果用OD490表示。

用如下公式計算細胞增殖抑制率：

1.6 統計學處理 所有數據用SPSS（13.0）統計軟件進行方差分析，結果用±s表示，P<0.05表示有統計學意義。

2 結果

與對照組比較,杜仲總黃酮為 25μg 、50μg、100μg、200μg/ml劑量組的 OD490吸光值均降低,濃度為 25μg 、50μg、100μg、200μg/ml的總黃酮均能抑制H1299細胞的增殖，作用效果具有較明顯的量效關系，與對照組比較有統計學意義（P＜0.05）。詳見附表1。

表1 杜仲總黃酮對H1299細胞的增殖抑制作用

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,發病率有逐年增高的趨勢。肺癌常規化療效果不甚理想,傳統抗癌藥難以避免選擇性差、毒副作用強等缺點,因此，一些天然物質及其衍生物對腫瘤的誘導分化和凋亡作用越來越受到重視[4]。

杜仲是為中國特有的貴重中藥材,早在《神農本草經》就記載了杜仲的藥效:“杜仲性味甘、微辛、溫、無毒,有補肝腎、強筋骨、益腰膝、除酸痛的效能”。近代醫學又證明了杜仲具有降壓、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、抗真菌防霉、抗骨質疏松作用等等。

杜仲的主要功效成分有木脂素類、環烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類、多糖類、杜仲抗真菌蛋白。本實驗通過提取杜仲皮中的總黃酮，直接作用于體外培養的人肺腺癌細胞H1299，初步觀察杜仲總黃酮的抗腫瘤作用。實驗結果表明，杜仲總黃酮濃度在25μg、50μg、100μg、200μg/ml 時 ， 均 能 抑 制 肺 癌 細 胞H1299增殖，與對照組相比，有統計學意義（P<0.05）。且隨著濃度的升高，其抑制增殖的作用不斷增強，有較明顯的量效關系。MTT法對細胞增殖測定的原理是利用細胞中線粒體能量代謝過程中產生的琥珀酸脫氫酶，將淡黃色的四甲基氮唑鹽MTT還原成藍紫色不溶于水的formazan結晶,形成的結晶與活細胞數量成正比,該結晶經DMSO溶解,能在波長490nm處形成吸收峰[5],故用該波長測定溶液的吸光度(OD)值,便能了解細胞的增殖情況。

在本實驗中,用不同濃度的杜仲總黃酮作用于H1299細胞，發現均對該細胞的增殖有抑制作用，初步說明杜仲總黃酮有直接抑制腫瘤細胞H1299增殖的作用。實驗提示，杜仲中總黃酮是其抗腫瘤成分之一。然而，杜仲總黃酮抗腫瘤活性的具體機制還有待進一步研究。

[1]盛軍利,孫桂菊.杜仲的功效學研究現狀及其應用前景[J].醫學綜述,2006,12(16):1022-1024.

[2]張德權,臺建祥,付勤.生物類黃酮的研究及應用概況[J].食品與發酵工業,1999,25(6):52-57.

[3]肖靜,李三華,莫寧萍,等.杜仲總黃酮對體外培養大鼠成骨細胞增殖的影響 [J].遵義醫學院學報，2008，31（3）：238-240.

[4]RaskatovasD.Chemop revention possibilities of lung cancer[J].Medicina(Kaunas),2004,40(12):1151-1157.

[5]林忠寧，董勝，董書蕓，等.MTT法檢測T淋巴細胞增殖功能的方法學探討與應用 [J].中國衛生檢驗雜志，2000，10（1）：8-10.