激光共聚焦顯微鏡檢測紫花地丁水浸出物對HBV的影響

王 玉，吳中明，羅 果，王美麗

（遵義醫學院，貴州 遵義563003）

紫花地丁(Viola Yedoensis Makino)屬堇菜屬,傳統醫學認為紫花地丁味苦、性寒,具有清熱解毒,抗菌消炎的功效。臨床上，紫花地丁及含有紫花地丁的方劑主要用于治療各種病原體感染,特別是慢性感染和自身免疫性疾病[1]。激光共聚焦顯微鏡(laser confocal scanning microscopy,LSCM)是一種新型高精度的激光源加共聚焦顯微鏡,可對活的或固定的細胞及組織標本的熒光定量分析,離子含量的實時動態分析檢測等。本實驗利用LSCM與間接免疫熒光結合，觀察紫花地丁對乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus,HBV)DNA全基因轉染的HepG2.2.15細胞[2，3]內的HBsAg、HBeAg和HBcAg的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 實驗細胞 HepG2.2.15細胞株，購于解放軍302醫院傳染病研究所病毒所。

1.2 主要儀器 激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2）。

1.3 主要試劑 ①MTT（華美生物工程公司）；②羊抗人-IgG-FITC（華美生物工程公司）；③抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc免疫血清（華美生物工程公司）。

1.4 實驗藥物 ①紫花地丁水提取物儲存液：稱取100 g紫花地丁，切碎后加適量超純水浸沒紫花地丁，置于4℃冰箱浸泡過夜。次日加熱煮沸，保持微沸浸出一定時間，重復煎煮3次，分離并收集各次煎出液，濃縮至250 mL溶液，濃度相當于每mL含400mg生藥量，過濾除菌分裝，置-20℃冰箱保存備用。②使用DMEM完全培養液配制各實驗濃度藥物。

1.5 實驗方法

1.5.1 細胞培養 HepG2.2.15細胞用含10%嬰牛血清、380mg/L G418（實驗用培養液不加）、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、用0.238%HEPS的DMEM培養液培養，每4～5天換1次培養液，約7d傳代1次。HepG2.2.15細胞為貼壁生長細胞，傳代時用0.25%胰酶消化。

1.5.2 MTT法測細胞毒性 ①接種細胞：將生長良好的HepG2.2.15細胞以5×104個/孔的密度接種于96孔培養板，置于37℃、5﹪CO2培養箱中培養。②藥物作用：HepG2.2.15細胞貼壁后經血清饑餓法進行細胞同步化后分組,實驗組分別加入含有3、0.6和0.12mg/ml紫花地丁水浸出物的培養液；陽性對照3TC組的終濃度為50μg/mL；不加藥物細胞對照組加入完全培養液。每孔均加入0.1 mL。每一濃度設5個平行孔。空白孔不加細胞，只加培養液。繼續培養3d、6d和9d后，每3天更換含藥培養液1次。③MTT法檢測：實驗結束后，采用酶標儀波長為490 nm（參考波長630nm）測定各孔A值[1]。按下列公式計算細胞破壞率和半數毒性劑量（TC50）。細胞破壞率(%)=[(細胞對照組平均A值-實驗組平均A值)/細胞對照組平均A值)]×100%。TC50=Antilog[A+(50-50%抑制百分率)×C/>50%抑制百分率-<50%抑制百分率]注：(A=log<50%藥物濃度,B=log>50%藥物濃度,C=B-A)。

1.5.3 細胞爬片的制備 將生長良好的HepG2.2.15細胞用0.25﹪胰酶消化后制成細胞懸液，以3.5×105個/孔的密度接種于放有滅菌蓋玻片的6孔培養板，置于37℃、5﹪CO2培養箱中培養。貼壁后經血清饑餓法細胞同步化處理后，進行實驗分組：實驗組加入3mg/mL紫花地丁水浸出物，陽性藥物對照組3TC濃度為50 μg/mL；細胞對照組加入完全培養液，每孔均加入2.0 mL。繼續培養3d后，取出爬片用PBS洗一次，冷丙酮固定10 min后，免疫熒光染色后上機檢測。

1.5.4 細胞爬片熒光染色法 已固定的細胞爬片用PBS洗5 min，在標本上覆蓋1：5的抗-HBe、抗-HBs免疫血清，4℃冰箱中孵育過夜→用PBS漂洗3×3 min→細胞未干前復加二抗（羊抗人IgG-FITC 1:8）37℃濕盒1h→用PBS漂洗3×3 min→PI室溫避光作用15 min→用PBS漂洗3×3 min→封片劑封片后用LSCM觀察，并進行熒光強度的定量分析。FITC和PI的激發波長分別是488nm和535nm。FITC檢測HB sAg、HBeAg和 HBcAg；PI檢測細胞核酸。

加抗-HBc前先用0.1﹪Triton X-100+10﹪小牛血清PBS溶液37℃孵育15 min，余步驟同上。

計算抗原抑制率,公式如下:抗原抑制率＝（細胞對照組熒光強度－藥物處理組熒光強度）/細胞對照組熒光強度×100%。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件分析數據，組間比較采用方差分析，各均數兩兩比較。

2 結果

2.1 紫花地丁的細胞毒性作用 在加入不同濃度的紫花地丁水浸出物和50μg/ml 3TC作用3d、6d和9d后，在倒置顯微鏡下觀察各紫花地丁水浸出物組細胞生長良好。MTT實驗發現紫花地丁水浸出物各濃度組均有不同程度促細胞生長作用 (P<0.05)，50μg/mL 3TC在第9天有明顯細胞毒性作用（P<0.05）。

2.2 HBsAg、HBeAg和 HBcAg在 HepG2.2.15細胞內的定位 LSCM下,HBsAg主要存在于細胞的胞漿、核膜和胞膜上；HBeAg主要在核內和胞漿內，核膜上沒有分布；HBcAg分布在胞漿和核內（見圖1）。

表1 紫花地丁水浸出物、3TC在HepG2.2.15細胞培養中對細胞的作用(OD 490nm,±s,n=5)Tab.1 The cell toxicity of the different concentrations of Viola Yedoensis Makino extract and 3TC on HepG2.2.15 cells.(OD 490nm,±s,n=5)

表1 紫花地丁水浸出物、3TC在HepG2.2.15細胞培養中對細胞的作用(OD 490nm,±s,n=5)Tab.1 The cell toxicity of the different concentrations of Viola Yedoensis Makino extract and 3TC on HepG2.2.15 cells.(OD 490nm,±s,n=5)

注：與細胞對照組比較:*P<0.05,**P<0.01;紫花地丁水浸出物各濃度組與3TC組比較：△P<0.05,△△P<0.01

?

圖1 激光共聚焦顯微鏡下HepG2.2.15細胞內HBsAg、HBeAg和HBcAg的分布（×200）Fig 1 Location of HBsAg,HBeAg and HBcAg in HepG2.2.15 cells by LSCM（×200）

2.3 藥物對細胞內HBsAg、HBeAg和HBcAg的影響 藥物處理3d后采用間接免疫熒光法標記HBs Ag、HBeAg和HBcAg，并隨機選取5個視野，記錄100個細胞的熒光強度。結果表明，紫花地丁水浸出物3mg/ml組對三種抗原均有抑制作用（P<0.01）；3TC 50μg/mL組對HBsAg和HBeAg有明顯抑制作用（P<0.01），但對 HBcAg無抑制作用（P>0.05）。兩種藥物對HBsAg抑制作用無顯著差異（P>0.05），紫花地丁水浸出物對HBeAg和HBcAg抑制作用更強（P<0.05）。

3 討論

本試驗主要研究紫花地丁水浸出物對HepG2.2.15細胞內HBsAg、HBeAg和HBcAg的影響以及三種抗原在細胞內的分布，為進一步了解紫花地丁對HBV的作用打下實驗基礎。本研究將紫花地丁作用的細胞爬片，用抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc特異性標記細胞內的相應抗原，再用羊抗人IgG-FITC標記一抗，在LSCM下直接觀察HBV抗原含量的變化。LSCM的激發光源為單波長的激光，因而能有效地避免細胞的自發熒光和非特異性熒光的出現，使所采集的圖像更清晰可靠[4,5]；同時，由于LSCM采集的是一個光學層面的圖像，所以能夠準確地定位出三種抗原在HepG2.2.15細胞內的分布。結果表明HBsAg主要分布在胞漿和胞膜，HBeAg分布在核內、胞漿和胞膜，HBcAg主要分布在核內和胞漿內。

表2 紫花地丁水浸出物和3TC在第3天對HepG2.2.15細胞內的HBsAg、HBeAg和HBcAg的影響Tab 2 The effect of Viola Yedoensis Makino estract and 3TC on HBsAg,HBeAg and HBcAg in HepG2.2.15 cells at 3th day.

我們曾證實紫花地丁對HepG2.2.15細胞分泌的HBsAg和HBeAg具有抑制作用[6]，本研究擬觀察紫花地丁對HepG2.2.15細胞內 HBsAg、HBeAg和HBcAg的影響。結果表明紫花地丁對細胞內三種抗原均有明顯抑制作用，其中對HBeAg的抑制作用優于拉米夫定。HBeAg是HBV復制及具有強感染性的一個指標,對于病毒在感染宿主中的生命周期至關重要，同時也是病毒基因的輔助產物。紫花地丁對胞內外HBeAg均有抑制作用，表明紫花地丁對HBV復制具有一定的抑制作用。本研究發現紫花地丁對HBcAg具有抑制作用，而拉米夫定無抑制HBcAg作用，HBcAg較HBsAg和HBeAg更能反映HBV的存在及其復制程度，它是HBV顆粒存在的直接標志，其與HBV DNA呈正相關，都可反映HBV的活動性復制。紫花地丁對HBcAg具有抑制作用,進一步說明其對HBV具有抑制作用。紫花地丁作用導致HBsAg、HBeAg和HBcAg含量減少說明其具有一定的抗HBV作用，但其作用機制還需進一步研究。

激光共聚焦顯微鏡現已廣泛用于病毒的熒光定量測量，共焦圖像分析等方面的研究，今后必將在抗病毒藥物篩選中發揮越來越重要的作用。

[1]李海濤，楊琳，章廣玲，等.紫花地丁煎劑調節小鼠巨噬細胞功能的體內實驗研究 [J].華北煤炭醫學院學報，2004，6（5）：553-554.

[2]Jia-Ming Chang,Kai-Ling Huang,Thomas Ta-Tuan,et al.The anti-hepatitis B virus activity of Boehmeria nivea extract in HBV-viremia SCID mice[J].eCAM,2007,1-7.

[3]張瑋，王育群，季光，等.芪黃沖劑體外（2.2.15細胞）抗病毒的藥效學研究 [J].現代中西醫結合雜志，2005，14（9）:1137-1140.

[4]周繼凱,李煥德.激光掃描共聚焦顯微技術在醫藥研究中的應用[J].中南藥學,2007,5(1):66-68.

[5]朱菁,李秀蘭,李惠芬.激光掃描共聚焦顯微技術及在藥學上的應用[J].天津藥學,2006,18(5):58-61.

[6]王玉,吳中明,敖弟書,等.紫花地丁對HepG2.2.15細胞分泌 HBsAg 的影響[J].遵義醫學院學報，2009，32（6）：559-566.