先天性心臟病圓錐動脈干畸形NKX2-5基因Cp G島甲基化狀態分析

盛偉 王慧君 馬曉靜 李文燦 陳龍 張進 黃國英 馬端，，*

（1.復旦大學上海醫學院分子醫學教育部重點實驗室，上海 200032；2.復旦大學生物醫學研究院，復旦大學出生缺陷研究中心，上海 200032；3.復旦大學附屬兒科醫院，復旦大學兒童發育與疾病轉化醫學研究中心，上海 200032；4.復旦大學法醫系，上海 200032）

先天性心臟病（congenital heart disease），簡稱先心病，是指胚胎發育過程中心臟結構發生異常的一類疾病。近年來出生缺陷調查資料顯示，先心病已躍居我國出生缺陷畸形首位，發病率占活產新生兒的6‰～10‰［1］。圓錐動脈干畸形（congenital heart conotruncal defects，CTD）是先心病中最為嚴重的一種類型，約占先心病的30%［2］。CTD是指在遺傳和環境因素的共同作用下，胚胎發育早期心臟流出道和大動脈發育異常，臨床上表現為法洛四聯癥、肺動脈閉鎖、大動脈轉位、右室雙出口、永存動脈干等多種復雜心血管畸形，常出現紫紺和低氧血癥，是造成我國嬰兒和新生兒死亡最主要的原因之一。

心臟特異性轉錄因子NKX2-5高度保守，是脊椎動物心臟育生中較早表達的轉錄因子，是心臟前體細胞最早的標志物，參與心臟發育的整個過程。NKX2-5自胚胎發育第7.5天開始持續表達，其正常表達對心臟的環化、心房及心室發育、動脈干分隔、房室瓣形成及房室傳導的維持均起重要作用［3］。動物實驗顯示，NKX2-5參與了胚胎心臟發育，是引起心臟畸形的關鍵因素，敲除NKX2-5基因的小鼠胚胎在10.5天由于心臟缺失而死亡［4］。臨床研究顯示，NKX2-5基因在患兒人群中發生突變的比例非常低，如法洛四聯癥和房間隔缺損患者中僅有4%發生突變［5］。最近也有學者提出，基因序列的改變不是NKX2-5引起心臟畸形的主要原因［6］。

除了編碼序列改變可以導致基因的功能異常以外，基因啟動子區域的甲基化變化也可以影響基因的表達，從而使所編碼的蛋白出現量的差異。本研究擬通過比較該基因在正常心臟組織與CTD病變組織中的甲基化狀態的差異，了解NKX2-5基因的甲基化狀態與CTD的關系，為先心病的早期基因診斷提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Tru1l限制性內切酶購自Fermentas公司，IPTG購自Promega公司，蛋白酶抑制劑購自Sigma公司，Glutathione Sepharose 4B購自GE Healt hcare公司，組織基因組DNA提取試劑盒購自AXYGEN公司，PCR產物回收試劑盒購自QIAGRN公司，LA Taq聚合酶、T4 DNA連接酶和實時定量PCR試劑均購自Ta KaRa公司，所有引物均在上海桑尼生物公司合成。含有PET4-GST-MBD重組質粒的大腸桿菌為本實驗室保存。

1.1.2 研究材料 正常兒童心臟組織取自復旦大學法醫學系。圓錐動脈干畸形病變組織由復旦大學附屬兒科醫院提供。本研究涉及的人體組織樣本均經所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 NKX2-5基因啟動子區Cp G島預測及Real Time PCR引物設計 登陸http：／／genome.ucsc.edu／網站，查找人的NKX2-5基因啟動子區，通過甲基化分析軟件（Methyl Primer Express v 1.0）確定啟動子區的Cp G島位置，根據Tru1l限制性內切酶的酶切位點，確定Real Time PCR的擴增區域，然后利用引物設計軟件（primer premier 5）設計Real Time PCR引物。

1.2.2 基因組片段化與接頭連接 組織樣品基因組DNA按照QIAGEN公司的組織基因組DNA提取試劑盒步驟進行提取。取正常心臟組織和CTD病變組織基因組各1μg，利用Tru1l限制性內切酶進行酶切，反應體系為：各基因組1μg，Tru1l酶1μL，10×buffer 2.5μL，補加滅菌蒸餾水至終體積為25μL，再加入10μL石蠟油防止蒸發，反應條件為65℃3～4小時，利用酶切回收試劑盒對酶切產物進行回收。接頭引物序列為：H-24，5-AGG CAA CTG TGC TAT CCG AGG GAT，H-12，5-TAA TCC CTC GGA。各取200μM的接頭引物100μL，94℃5分鐘，然后將2種引物匯合，自然冷卻形成接頭。利用T4 DNA連接酶，將基因組DNA酶切回收產物與制備的接頭進行連接，反應體系為：10×T4 buffer 5μL，酶切回收產物 10μL，接頭 2μL，PEG4000 4μL，T4連接酶2μL，補加滅菌蒸餾水至終體積為50μL，反應條件為16℃，過夜。

1.2.3 GST／MBD融合蛋白的表達純化及活性檢測將含有PET4-GST-MBD重組質粒的大腸桿菌在LB-Kan平板上進行劃板，37℃培養過夜；挑取單克隆，接種于10ml LB-kan液體培養基中；次日將培養液接種于200ml LB-kan液體培養基中進行擴大培養；用終濃度為1m M的IPTG誘導3～4小時以表達GST／MBD融合蛋白，分別在1.5小時（誘導前）、4小時（誘導后）取待檢測樣品，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍染色檢測誘導表達結果。200ml誘導后菌液離心后懸浮在PBS-T（1%Triton X-100）緩沖液中，此緩沖液中含有終濃度為1m M的PMSF和50mg／ml的溶菌酶，冰上放置30分鐘，超聲破碎細胞，溶解產物經高速離心，上清過Glutathione Sepharose 4B層析柱，并用10倍柱體積的PBS洗去非特異性結合的蛋白，用低鹽濃度結合緩沖液洗去大腸桿菌DNA，最后獲得純化的GST／MBD蛋白［7］。本實驗室前期研究已證實，采用不同的鹽離子強度的緩沖液進行洗脫，可以把甲基化的DNA和非甲基化的DNA分開，實驗條件為：100m M NaCl緩沖液為結合緩沖液，500m M NaCl緩沖液為洗滌緩沖液，1 000m M NaCl的緩沖液為洗脫緩沖液［8］。

1.2.4 基因組中甲基化DNA富集 取GST／MBD蛋白層析柱100μL，離心去上清，用100μL 500m M NaCl的洗滌緩沖液平衡2次，在含有100m M NaCl的結合緩沖液中結合基因組DNA，放在搖床上4℃結合1小時。用500m M NaCl的緩沖液洗滌，以去除非甲基化DNA，最后用1 000m M NaCl的洗脫緩沖液洗脫并回收甲基化DNA。

1.2.5 LM-PCR擴增富集甲基化DNA 由于富集下來的甲基化DNA量較少，不能滿足后續實驗的要求，因此需要對富集的甲基化DNA進行有效的擴增。以富集的甲基化DNA為模板，H24為引物進行2輪LM-PCR擴增，從而獲得足夠量的富集甲基化DNA的PCR產物，用PCR產物回收試劑盒進行純化回收，-20℃儲存以備后續研究。

1.2.6 Real Time PCR檢測樣本中NKX2-5基因的甲基化狀態 采用SYBR Green Real Time檢測樣本NKX2-5基因啟動子區CpG島的甲基化狀態。實驗中選取6例先天性圓錐動脈干畸形組織樣本和1例正常心臟組織樣本作為研究對象，各取100ng富集甲基化DNA LM-PCR產物為模板，以DXZ4為內參，利用比較定量法，根據Ct值與起始模板拷貝數呈線性關系，分析不同樣本中Ct值的變化，每個樣本重復3次，取其平均值。反應體系及反應條件嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 NKX2-5基因啟動子區Cp G島的預測及Real Time PCR擴增區域的確定 利用http：／／genome.ucsc.edu／網站及甲基化分析軟件（Methyl Primer Express v1.0）確定NKX2-5基因轉錄起始點上游5kb內有3個Cp G島（圖1），根據Tru1l酶切片段的大小以及啟動子區的確定，本研究選取了Cp G島2中的1段，利用引物設計軟件（primer premier 5）設計Real Time PCR引物，其上游引物為：GGCTTTGATGAGGGACAGGA，下游引物為CAAGGTGCGGAGGAAACG，產物長度為162bp。

圖1 NKX2-5基因啟動子區Cp G島分布

2.2 基因組DNA片段化與接頭連接分析 Tru1l酶切位點是TTAA，對基因組DNA進行酶切時可以保留絕大部分Cp G點的完整性，同時片段化基因組的大小集中在300～700之間（圖2A），符合實驗的預期目標。接頭連接的成功與否直接關系到后續實驗的成敗。以連接產物為模板，H24為引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析表明接頭連接成功（圖2B）。

2.3 GST／MBD融合蛋白的表達純化 含有PET4-GST-MBD重組質粒的大腸桿菌，用IPTG誘導表達GST／MBD融合蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果表明，在菌液的上清中有大量的融合蛋白表達，表達的融合蛋白經過Glutathione Sepharose 4B柱純化，可以得到純度較高的蛋白，其分子量大小與預期大小一致（圖3）。

2.4 Real Time PCR檢測結果分析 通過Real Time PCR檢測，與正常心臟組織相比，不同CTD病變組織中NKX2-5基因的Ct值發生不同程度的改變（表1），其值變化范圍在15～35之間，屬于正常分析范圍；根據其擴增曲線（圖4）以及RQ柱狀圖分析（圖5），樣本T8、T11、T27和T76呈現高甲基化，分別是正常心臟組織樣本的3.5、4.2、2.1和2.4倍，T6和T19則無明顯變化。

圖3 GST／MBD融合蛋白的表達和純化

表1 正常心臟組織和不同病變組織樣本中NKX 2-5基因Real Time PCR Ct值

圖4 NKX2-5基因啟動子甲基化Real Time PCR擴增曲線圖

圖5 NKX2-5基因啟動子甲基化Real Time PCR RQ檢測結果

3 討論

人NKX2-5基因定位于染色體5q35，含2個外顯子，編碼324個氨基酸。NKX2-5基因位于眾多對心臟發育有重要作用基因的上游，如TFGBR3、EDG7、BMP10、CX43、NPPA，以及最近發現的Etsrp71和Chibby等。應用原位雜交技術發現在NKX2-5基因純合敲除小鼠中，Anp、MeCP2C、Carp等基因表達受到嚴重干擾［9］。同時，NKX2-5基因也受 Nodal、Shh／Ihh、Wnt、Notch和BMP2等多個早期胚胎發育相關的信號通路調節［10］。

NKX2-5基因啟動子區存在多個具有重要功能的啟動子、增強子，以及抑制因子和自動調節因子的結合元件。這些元件在與相應的轉錄因子結合后，在不同的時間和空間調控NKX2-5基因的表達。本研究利用甲基化結合蛋白（MBD）能夠與甲基化DNA特異性結合的特性，將酶切后片段化的基因組甲基化DNA進行有效地富集，同時根據Real Time PCR中Ct值與起始模板拷貝數呈線性關系這種理論，利用SYBR Green Real Time PCR檢測CTD樣本和正常心臟樣本中NKX2-5基因啟動子區Cp G島的甲基化狀態。結果表明，該方法靈敏度高，準確性強，能夠有效地檢測出不同樣本之間的甲基化狀態。在所測的6例CTD組織樣本中，與正常組織樣本相比，4例呈現高甲基化，2例甲基化狀態改變不明顯。由此推斷，NKX2-5基因表達異常可能與該基因啟動子區甲基化有關。今后我們將擴大樣本檢測量，以進一步證實這個重要的現象。

總之，在本研究中，通過Real Time PCR檢測，我們發現在CTD病變組織中NKX2-5基因啟動子區Cp G島發生了不同程度的甲基化，表明該基因啟動子區Cp G島甲基化可能與先心病的發生有關。同時，這種變化有可能對先心病的早期基因診斷有價值，值得進一步探索。

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