密度梯度離心和免疫磁珠分選相結合分離臍血中胎兒有核紅細胞

羅欣 杜穎穎 張進 馬端，2*

（1.復旦大學上海醫學院 分子醫學教育部重點實驗室，上海 200032；2.復旦大學生物醫學研究院 出生缺陷研究中心，上海 200032）

產前診斷是對胚胎或胎兒在出生前是否患有某些遺傳病或先天畸形做出準確的診斷。目前采用的診斷方法多屬于有創性檢查，對妊娠婦女和胎兒都有一定的風險［1］。從妊娠婦女外周血中分離胎兒有核紅細胞（fetal nucleated red blood cells，FNRBCs）進行基因分析已成為國內外無創性產前診斷的研究熱點。但是母體循環中的FNRBCs數量稀少，難以達到臨床檢測的要求，高效富集FNRBCs方法已成為產前診斷中篩查染色體異常和基因異常的必要手段。本研究通過結合密度梯度離心和免疫磁珠分選的方法提高分選后FNRBCs的純度。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2007年5月至2008年3月在復旦大學附屬婦產科醫院足月分娩的健康胎兒臍血5例，每例6ml，EDTA抗凝。

1.2 實驗方法

1.2.1 密度梯度離心 用Ficoll（美國Sigma公司）制備密度1.119／1.107／1.077的三重梯度，每個梯度2ml，依次加入15ml離心管中。將血標本：0.1MPBS=2：3（V／V）進行稀釋，稀釋后的血標本緩置于6ml密度梯度液上，室溫22℃，400g×40min。在1.077和1.107密度界面上，可見呈白膜狀的細胞層面。此層面即為富含單個核細胞，用槍頭輕輕插到此層，將細胞轉移入50ml管中，加入30ml PBS／1%BSA，300g×10min，棄上清，細胞沉淀再用相同的方法洗2次以去除殘留的密度梯度液，最后細胞沉淀重懸于300ul PBS／0.1%BSA中，吹勻。

1.2.2 細胞計數 取2ul重懸液加入198ul PBS中（即稀釋100倍），光鏡下計數4大格細胞數，重復1遍。8大格細胞數×100（稀釋倍數）×104=細胞數／ml。取106個細胞，用 PBS／0.1%BSA 補足80ul。

1.2.3 免疫磁珠分選 加入20ul CD71抗體磁珠（德國美天旎公司）4℃ 放置15min。300g×10min，棄上清，加入1ml PBS／0.1%BSA，重懸沉淀后，300g×10min，棄上清，沉淀重懸于500ul PBS／0.1%BSA。組裝美天旎磁珠分選系統。以500ul PBS／0.1%BSA潤洗美天旎分選柱，待流空后，將分選的細胞上柱，收集流出液，標記為陰性細胞。取500ul PBS／0.1%BSA潤洗管子，待流空后再重復2次，最后。取500ul PBS／EDTA／BSA加入分選柱，待流空后再重復一次。最后取1ml PBS／0.1%BSA加入分選柱，拿離磁場，沖洗入15ml管內，標記為陽性細胞。

1.2.4 免疫熒光染色 分選前細胞、分選后的陰性細胞、陽性細胞按1×105個細胞加入PE標記的CD45單克隆抗體（德國美天旎公司）和FITC標記的CD71單克隆抗體（德國美天旎公司）20μl，室溫避光孵育30min，PBS洗3遍，1%多聚甲醛固定。流式細胞儀檢測。

1.2.5 涂片Wright's-Giemsa染色 同時取分選前細胞、密度梯度離心后細胞和分選后陽性細胞進行細胞涂片，涂片后先用瑞氏染液將涂膜面充分覆蓋。稍等片刻待染液干后加吉姆薩染液1～2滴，用槍頭引導染色覆蓋涂膜面。等1～2min，再將PBS（PH6.4）一滴一滴地加到涂片膜上，直至膜面上染色液形成把表面張力而終止染色液進入（PBS的用量為瑞氏吉姆薩染液之和的兩倍）。染色10min，分色，用自來水沖洗至顏色明顯變淡（3min），鏡下觀察。

2 結果

2.1 CD71分選結果 通過流式細胞儀檢測發現CD71單克隆抗體磁珠用于臍血中胎兒有核紅細胞分選（CD71+，CD45-），分選后的純度可以達到81%，而分選前CD71陽性細胞只占23.2%（圖1）。

BLANK001：無標記的細胞，QIAN002：分選前細胞CD71和CD45雙標記，HOU+004：分選后陽性細胞CD71和CD45雙標記，HOU-003：分選后陰性細胞CD71和CD45雙標記。

2.2 形態學觀察

2.2.1 分選前臍血涂片可見大量的成熟紅細胞，有核細胞以淋巴細胞、粒細胞和單核細胞為主，含少量有核紅細胞（圖2）。

2.2.2 三重密度梯度離心后取單個核細胞層，可見絕大多數細胞為單個核細胞（淋巴細胞、單核細胞和有核紅細胞），含少量紅細胞（圖3）

圖1 CD71磁珠分選的結果

圖2 分選前的臍血涂片瑞式吉姆薩染色（×400）

圖3 三重密度梯度離心后細胞涂片瑞式吉姆薩染色（×400）

2.2.3 CD71單克隆抗體磁珠分選后陽性細胞多為胞漿豐富略嗜堿性的有核紅細胞（圖4、圖5）。

圖4 分選后陽性細胞瑞式吉姆薩染色（×400）

圖5 分選后陽性細胞瑞式吉姆薩染色（×1000）

3 討論

早在1893年Schmorl［2］首先提出孕婦外周血中存在胎兒細胞，該觀點今年已經被一些研究證實［3］。這就為非侵入性產前診斷提供了很好的理論依據。Lo等［4］研究表明母血中胎兒細胞數量隨孕周的增加而增加，且存在于整個孕期，使其成為很好的診斷材料。但是應用孕婦外周血胎兒細胞進行產前診斷已發展近20年，仍然因為技術和價格的局限性不能廣泛在臨床中使用，因此高效富集母血中的FNRBCs已經成為開展無創性產前診斷的關鍵。FNRBC是單核細胞，含有胎兒全部的遺傳物質。它在孕婦外周血中的生存期比較短［5］，并且有區別于其他細胞的多種篩選標記，如轉鐵蛋白受體（CD71）、血栓敏感素受體（CD36）等。目前用于分選FNRBCs的方法主要有：密度梯度離心（DGC）、流式細胞計數分選法（FACS）、顯微操作發、免疫磁珠分離法、選擇性紅細胞裂解、凝集素富集法等。但是這些方法存在成本高或特異性不強等因素。雖然Bianchi等［6］研究表明FACS是迄今為止最佳分選富集胎兒細胞的方法，但FACS的缺點是設備昂貴、操作步驟較復雜、可影響細胞的形態。本試驗采用密度梯度離心和免疫磁珠分選相結合的方法，既可以排除密度梯度離心法獲得細胞數量少，純度不高且容易造成丟失的缺點［7］，又可以減少因為CD71在母體淋巴細胞、成熟紅細胞、網織紅細胞、血小板表面也有一定程度表達造成的污染［8］。經過對分選前后細胞進行流式細胞分析技術和染色，此方法可以對臍血中FNRBCs進行很好的分選，并達到比較理想的分選純度（81%）。優化后的實驗方法可以運用于分選孕婦外周血中的FNRBCs。

［1］Firth HV，Boyd PA ，Chamberlain PF ，et al.Analysis of limb reduction defect s in babies exposed to chorionic villus sampling［J］.Lancet，1994，8905：1069-1071.

［2］Schmorl G.Uberdas Schicksal embolisch verschleppter［J］.Placentarzellen Zentrabl Gynakol，1950，29：129.

［3］Simpson J L，Elias S.Isolating fetal cells from maternal blood：advances in prenatal diagnosis through molecular technology［J］.JAMA，1994，210：2357-2361.

［4］Lo YMD，Tein MSC，Lau TK，et al.Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum：implications for noninvasive prenatal diagnosis［J］.Am J Hum Genet，1998，4：768-775.

［5］Gussin，HeleneA，Elischal，et al.Culture of fetal cells from maternal blood for prenatal diagnosis［J］.Oxford University Press，2002，6：523-527.

［6］Bianchi DW，Flint AF，Pizzimenti MF，et al.Isolation of fetal DNA from nucleared erythrocyte in maternal blood［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：3279-3283.

［7］Zhong XY，Hahn S，Steinborn A，et al.Quantitative analysis of intact fetal cells in maternal plasma by real2time PCR［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2006，1：20-24.

［8］陳漢平，賀桂芳.孕婦外周血中胎兒細胞及胎兒DNA的檢測［J］.中國實用婦科與產科雜志，2002，10：596-598.