靈菌紅素對有害藻類的除藻活性研究

劉伯雅,魏東芝,魯思然,周文瑜,沈亞領*,徐 韌,王金輝(.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室,上海 007；.國家海洋局東海環境監測中心,上海 007；.武漢大學生命科學學院,湖北 武漢4007)

靈菌紅素對有害藻類的除藻活性研究

劉伯雅1,魏東芝1,魯思然3,周文瑜1,沈亞領1*,徐 韌2,王金輝2(1.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室,上海 200237；2.國家海洋局東海環境監測中心,上海 200137；3.武漢大學生命科學學院,湖北 武漢430072)

研究了沙雷氏菌的天然產物靈菌紅素對引起海洋赤潮和淡水水華的有害藻類的除藻活性和光解性質.結果表明,5.0μg/mL靈菌紅素能夠在24h內將新月菱形藻、中肋骨條藻、水華魚腥藻和微小平列藻培養液中的藻類全部殺死,除藻活性高達100%.5.0μg/mL靈菌紅素在30000lx光強下36h完全分解,不會給自然環境帶來二次污染.

靈菌紅素；除藻；赤潮；水華；光解

Abstract：Prodigiosin (PG), a secondary metabolite (red pigment) produced by Serratia marcescens and other bacteria, possesses a lot of bioactivity. However, its algicidal effect was not researched in detail. The algicidal activity of prodigiosin against harmful algae, causing red tide and fresh water bloom, and its light decomposition were studied. The algicidal concentration of prodigiosin for completely killing harmful algae in 24 hours including Nitzschia closterium, Skeletonema costatum, Anabena flosaquae and Merismopedia spp. were 5.0 μg/mL. When 5.0 μg/mL prodigiosin was exposed under the light of 30000lx for 36 h, all prodigiosin was photodecomposed. The light sensistivity of prodigiosin will not bring secondary pollution to the natural environment.

Key words：prodigiosin；algicidal effect；red tide；water blooms；photodecomposition

由于海洋、湖泊、水庫等水體的富營養化,各種藻類大量繁殖導致赤潮和水華的暴發.黏土[1]、硫酸銅[2]、有機農藥[3-4]、溶藻病毒[5]、溶藻細菌[6]、濾食性魚類[7]、水生植物[8]以及植物化感作用[9]等各種物理、化學、生物方法被應用于赤潮和水華的治理.但物理、化學方法均不可避免地將造成環境二次污染.生物方法總體上尚處于初期研究階段,仍有不少問題需要解決.因此,開發一種見效快、用量少、對環境友好、儲存和運輸方便的除藻劑成為解決赤潮和水華問題的迫切需要.

靈菌紅素(prodigiosin)是一類天然紅色素家族的總稱, 是由多種放線菌(Streptomyces)和細菌(Serratia, Pseudomonas)產生的一類次級代謝產物[10-11].韓國科學家在海邊土壤里篩選到一株能生產靈菌紅素的海洋細菌,并將其命名為Hahella chejuensis KCTC2396,該細菌生產的抗生素具有強烈的細胞溶解酶活性,對海洋赤潮藻C.polykrikoides具有較好的除藻活性[12].日本科學家在海邊篩選到一株能生產靈菌紅素類似物PG-L-1的海洋細菌MS-02-063,通過實驗發現,該靈菌紅素類似物對H.akashiwo、H.circularisquama、C.polykrikoides、Gyrodinium impudicum和Alexandrium tamarense具有一定的除藻活性[13].

本實驗通過黏質沙雷氏菌發酵生產靈菌紅素,并對其進行分離純化及鑒定,進而研究靈菌紅素對新月菱形藻、中肋骨條藻、水華魚腥藻和微小平列藻的除藻活性以及光解特性.

1 材料與方法

1.1材料

實驗所用黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)為本實驗室保藏.新月菱形藻(Nitzschia closterium)和中肋骨條藻(Skeletonema costatum)由中國海洋大學微藻種質庫提供.水華魚腥藻(Anabena flos-aquae)和微小平列藻(Merismopedia spp.)由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供.

NLF 22 30L生物反應器(瑞士比歐生物工程公司);752型紫外光柵分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);高速冷凍離心機(Eppendorf公司);高效液相色譜儀(Agilent Technologies, Inc.); Agilent orbax SB-C18色譜柱; Micromass LCT TOF質譜儀;水沖式真空泵(鄭州長城科工貿有限公司); SPX-300B-G光照培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠);XB-K-25血球計數板(浙江省玉環縣求精醫用儀器廠); CoolPIX 4500顯微鏡(Nikon).

葡萄糖為工業級,酵母粉和蛋白胨購自OXOID公司,其余試劑均為分析純.

黏質沙雷氏菌種子培養基(g/L):酵母粉1,蛋白胨2,甘油12.6,(NH4)2SO46, K2HPO410, NaCl 0.5, MgSO40.5.以NaOH調pH值至7.2.

發酵培養基(g/L):蛋白胨30,葡萄糖5,K2HPO40.2, ZnSO40.5, MnSO40.04, NaCl 0.5.以NaOH調pH值至7.2.

1.2實驗方法

1.2.1發酵培養參數控制 通過流加氨水閉環控制pH在7.0,通過調節通氣量及增大轉速來維持菌體生長所需的氧氣,維持DO大于20%.

1.2.2海洋赤潮微藻的培養 新月菱形藻和中肋骨條藻采用改良的f/2培養液在光照培養箱中培養,培養箱內溫度23℃,光強為3000lx,采用12h光暗循環培養模式.每天定時搖晃4～5次.

1.2.3淡水水華微藻的培養 水華魚腥藻和微小平列藻采用BG11培養液在光照培養箱中培養,其他條件同海洋赤潮微藻.

1.2.4靈菌紅素的分離純化 在黏質沙雷氏菌發酵液中添加硫酸銨使其濃度為200g/L,充分攪勻后置于4℃冰箱內隔夜存放,第2d7000r/min離心15min,收集菌體和蛋白沉淀物,按體積比1:10將離心沉淀物混勻于酸性甲醇溶液中進行靈菌紅素萃取,旋轉蒸發濃縮去溶劑,濃縮液用乙酸乙酯溶解,低溫靜置,除去不溶物雜質,得到靈菌紅素的乙酸乙酯溶液,以氯仿與乙酸乙酯混合液(體積比2:1)為流動相, 經過第1次硅膠柱層析,靈菌紅素洗脫液濃縮去溶劑,再經過第2次硅膠柱層析梯度洗脫,流動相為正己烷與乙酸乙酯混合溶液(體積比 5:1),除去黃色素等雜質;再以正己烷與乙酸乙酯混合溶液(體積比 1:1)為流動相洗脫靈菌紅素,洗脫液經過蒸發濃縮得到靈菌紅素樣品.

將得到的樣品進行紫外全波長掃描、高效液相色譜分析和TOF-MS質譜鑒定.

高效液相色譜檢測條件:儀器為高效液相色譜儀;流動相為10%的50mmol/L三乙胺＋90%乙腈,用磷酸調節pH值至6.0;檢測波長為535nm;色譜柱為Agilent orbax SB-C18(250 mm×4.6mm, 5μm);柱溫40℃;流速1mL/min;進樣量10μL.

1.2.5靈菌紅素除藻實驗 將分離純化得到的靈菌紅素樣品用極少量甲醇溶解,再用純水稀釋至不同的濃度梯度, 添加0.6mL靈菌紅素稀釋液至達到對數生長期的藻液29.4mL中,搖勻,各藻的初始藻細胞密度均為1.0×105個/mL.因為靈菌紅素具有光解的特性,為了最大限度的發揮靈菌紅素的除藻作用效果,本實驗將添加靈菌紅素的藻液首先置于培養箱中黑暗條件下培養12h,然后繼續按照光暗循環模式培養,定時取樣,顯微鏡下計數,只計數沒有發生裂解的完整的藻細胞,確定靈菌紅素的除藻活性.將不添加靈菌紅素的藻液作為對照.

1.2.6靈菌紅素光解實驗 將裝有5.0μg/mL靈菌紅素溶液的試管分別暴露于3000lx和30000lx燈光下, 觀察靈菌紅素水溶液的顏色變化,測定水溶液里靈菌紅素含量.

1.3分析方法

1.3.1藻細胞的計數和形態觀察 將培養容器內的藻液混勻,取一滴至血球計數板的計數室內計數.將血球計數板置于Nikon顯微鏡下觀察,放大倍數為400倍.除藻活性(%)＝[(初始培養液中活藻細胞密度－靈菌紅素作用后培養液中活藻細胞密度)/初始培養液中活藻細胞密度]×100

1.3.2靈菌紅素的測定 采用分光光度法測定靈菌紅素濃度.1mL發酵液加入9mL酸性甲醇(pH 3)中, 振蕩后離心,測上清的OD535值,由標準曲線得靈菌紅素的濃度.標準曲線:Y=3.939X+ 0.0265(R2=0.9996),其中Y為靈菌紅素濃度;X為靈菌紅素溶液OD535測定值.光解率(%)=[(初始靈菌紅素濃度–殘留靈菌紅素濃度)/初始靈菌紅素濃度]×100.

2 結果

2.1靈菌紅素的分離及鑒定

將樣品經過分離純化后進行高效液相色譜分析,見圖1.與空白進樣結果對比可知,6.2min, 535nm處的峰值為樣品溶質峰.由此可判斷硅膠柱二次層析后的樣品純度較高,＞95%.

圖1 靈菌紅素HPLC分離圖譜Fig.1 The HPLC analysis of prodigiosin

最終分離得樣品通過紫外全波長掃描儀(圖2),質譜儀測定確為靈菌紅素.樣品在堿性和酸性條件下的最大吸收波長分別為466nm和535nm.樣品的質譜分析結果表明m/z=324(圖3),其分子量323恰好是靈菌紅素分子對應的分子量,進一步證實樣品為靈菌紅素.紫外全波長掃描和質譜分析結果與文獻[14-15]報道一致.

2.2靈菌紅素對新月菱形藻的除藻活性

圖2 堿性與酸性條件下的紫外全波長掃描圖譜Fig.2 The scan map of alkaline and acidic prodigisoin in all-wavelengh

圖3 靈菌紅素的TOF MS圖譜Fig.3 The TOF MS analysis of prodigiosin

由圖4可見,添加5.0μg/mL靈菌紅素12h后,除藻活性接近80%,添加10.0μg/mL靈菌紅素12h后,除藻活性達到100%,藻類幾乎全部裂解死亡.將除藻活性達到100%的藻液重新接種到新鮮培養基中培養5d,鏡檢觀察未發現形態完好的新月菱形藻細胞,由此可進一步確證,裂解的藻細胞已經死亡.

未添加靈菌紅素的新月菱形藻經過3d的培養, 藻細胞密度由初始的1.0×105個/mL增殖到5.35×105個/mL,藻液中未發現裂解的藻細胞.

圖4 靈菌紅素對新月菱形藻的除藻活性Fig.4 Algicidal effects of prodigiosin against Nitzschia closterium

2.3靈菌紅素對中肋骨條藻的除藻活性

圖5 靈菌紅素對中肋骨條藻的除藻活性Fig.5 Algicidal effects of prodigiosin against Skeletonema costatum

由圖5可見,添加7.0μg/mL靈菌紅素0.5h后,除藻活性接近100%,添加1.0μg/mL靈菌紅素18h后, 除藻活性達到100%,中肋骨條藻幾乎全部裂解死亡.將除藻活性達到100%的藻液重新接種到新鮮培養基中培養5d,鏡檢觀察未發現形態完好的中肋骨條藻細胞.與圖4對比,低濃度靈菌紅素在短時間內可將中肋骨條藻全部殺死,這表明中肋骨條藻對靈菌紅素的敏感性比新月菱形藻強.

未添加靈菌紅素的中肋骨條藻經過3d的培養, 藻細胞密度由初始的1.0×105個/mL增殖到2.0×105個/mL,藻液中未發現形態遭到破壞的中肋骨條藻細胞.

受靈菌紅素作用前與作用后2h的中肋骨條藻藻細胞的形態學觀察表明,正常的中肋骨條藻細胞透鏡形或圓柱形,殼面圓而鼓起,輪廓圓滑,而受靈菌紅素作用后的藻細胞質濃縮,細胞破裂,輪廓不清晰,形態上發生了很大變化.

2.4靈菌紅素對水華魚腥藻的除藻活性

由圖6可見,添加5.0μg/mL靈菌紅素6h后,除藻活性超過75%,24h后, 除藻活性可達100%.而添加1.5μg/mL靈菌紅素12h后,除藻活性也達到90%.將除藻活性達到100%的水華魚腥藻培養液重新接種到新鮮培養基中培養5d,未發現細胞增殖.

未添加靈菌紅素的水華魚腥藻經過3d的培養,藻細胞密度由初始的1.0×105個/mL增殖到2.95×105個/mL.

圖6 靈菌紅素對水華魚腥藻的除藻活性Fig.6 Algicidal effects of prodigiosin against Anabena flos-aquae

2.5靈菌紅素對微小平列藻的除藻活性

由圖7可見,添加5.0μg/mL靈菌紅素24h后,除藻活性達到100%,添加1.5μg/mL靈菌紅素24h后,除藻活性接近80%.將除藻活性達到100%的微小平列藻培養液重新接種到新鮮培養基中培養5d,未發現形態完好的藻細胞.

而未添加靈菌紅素的微小平列藻經過3d的培養, 藻細胞密度由初始的1.0×105個/mL增殖到2.74×105個/mL.

圖7 靈菌紅素對微小平列藻的除藻活性Fig.7 Algicidal effects of prodigiosin against Merismopedia spp.

受靈菌紅素作用前與作用后12h的微小平列藻藻細胞的形態學觀察表明,正常的微小平列藻呈圓形或橢圓形,兩兩排在一起, 輪廓圓滑,呈深綠色;而受靈菌紅素作用后的藻細胞破裂,胞質外泄, 輪廓不清晰,藻體顏色變淺, 細胞開始凋亡.

2.6靈菌紅素的光解性質

靈菌紅素水溶液在光的照射下,紅色逐漸變淺,最終褪去.由圖8所示,在光強為30000lx的強光照射36h后,5.0μg/mL靈菌紅素幾乎完全分解,隨著照射光強度減小,靈菌紅素分解速率變慢,在光強為3000lx的燈光照射48h后,超過60%的靈菌紅素被光解.

圖8 靈菌紅素的光解率變化Fig.8 Photodecomposition of prodigiosin

2.7討論

本研究發現,由陸生細菌黏質沙雷氏菌所生產的次級代謝物靈菌紅素不僅對引起我國東海赤潮的有害藻類新月菱形藻和中肋骨條藻有很好的除藻效果,而且對引起淡水水華的有害藻類水華魚腥藻和微小平列藻也具有較好的除藻效果.其中靈菌紅素對引起淡水水華的藻類的除藻研究在國內尚屬首次.由于靈菌紅素的光解特性,經過靈菌紅素處理的藻液首先置于培養箱中在黑暗條件下培養12h,然后再進行光暗循環模式培養.5.0μg/mL靈菌紅素能夠在24h內將新月菱形藻、中肋骨條藻、水華魚腥藻和微小平列藻培養液中的藻類全部殺死,除藻活性高達100%.隨著靈菌紅素濃度的降低,其除藻活性也在降低.另外,從圖4、圖5、圖6和圖7中可以看到,靈菌紅素對各種藻類作用12h后,其除藻活性與時間的比值減小,在24h之后繼續減小,說明靈菌紅素除藻活性隨時間延長有所降低,這是由于經過靈菌紅素處理的藻液在12h黑暗模式培養之后,進入光照模式培養,藻液中的靈菌紅素在12h之后逐步光解,濃度下降所致.而未添加靈菌紅素的藻液經過3d培養,藻細胞均大量增殖.

Landsberg[16]和Yamasaki等[17]分別發現了多環旋溝藻和米氏凱倫藻能夠分泌活性氧(ROS),可以推測,大多數海洋藻類可能都能夠分泌活性氧.活性氧對于某些海洋藻類來說,可能是重要的生長因子或有絲分裂刺激物[18].Kim等[19]認為活性氧合成酶類似于NADPH氧化酶. NADPH氧化酶能夠被靈菌紅素類似物抑制[20].因此, 靈菌紅素也可能對NADPH氧化酶和ROS合成酶起到抑制作用, 進而抑制藻細胞分泌活性氧,最終導致藻類細胞的裂解死亡.靈菌紅素除藻機理有待深入研究.

3 結論

3.1由黏質沙雷氏菌發酵生產的天然紅色素經分離、純化,鑒定為靈菌紅素.

3.2靈菌紅素具有高效的除藻活性.5.0μg/mL靈菌紅素能夠在24h內將新月菱形藻、中肋骨條藻、水華魚腥藻和微小平列藻培養液中的藻類全部殺死,除藻活性高達100%.隨著靈菌紅素濃度的降低,其除藻活性也在降低.

3.3靈菌紅素具有光解特性.在光強為30000lx燈光照射下,5.0μg/mL靈菌紅素能夠在36h內完全分解.而在光強為3000lx的燈光照射下,靈菌紅素在14h內可分解大約50%.

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致謝：本論文的除藻活性研究工作由東海環境監測中心徐韌主任、王金輝科長以及其他科室成員等協助完成, 在此表示感謝.

Algicidal activity of prodigiosin against harmful algae

. LIU Bo-ya1, WEI Dong-zhi1, LU Si-ran3, ZHOU Wen-yu1, SHEN Ya-ling1*, XU Ren2, WANG Jin-hui2(1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China；2.East China Sea Environmental Monitoring Center, State Oceanic Administration, Shanghai 200137, China；3.College of Life Science, Wuhan University, Wuhan 430072, China). China Environmental Science, 2010,30(4)：477～482

X52

A

1000-6923(2010)04-0477-06

劉伯雅(1983-),男,河北任丘人,華東理工大學碩士研究生, 主要從事微生物學研究.

2009-08-19

國家“863”項目(2007AA092004);上海市重點學科建設項目(B505)

* 責任作者, 教授, ylshen@ecust.edu.cn