純氧或空氣環境復蘇對新生大鼠缺氧性大腦皮質神經元超微結構的影響

高雪松,王自能

(暨南大學附屬第一醫院婦產科,廣州 510632)

研究報告

純氧或空氣環境復蘇對新生大鼠缺氧性大腦皮質神經元超微結構的影響

高雪松,王自能

(暨南大學附屬第一醫院婦產科,廣州 510632)

目的 應用缺氧動物模型比較純氧環境(pure oxygen environm ent,POE,100%氧)與空氣環境(room air environm ent,RAE,21%氧)復蘇對新生大鼠缺氧性大腦皮質神經元超微結構的影響。方法7日齡20只SD (Sp rague Daw ley)乳鼠建立缺氧2.5 h模型后,分為純氧環境組(POE)和空氣環境組(RAE),每組再根據復氧后時間點分為2個亞組,即24 h組和72 h組,每亞組5只。按時間點取各組乳鼠大腦半球右側額頂皮質行電鏡樣品制備,透射電鏡觀察。結果復氧各組均可見神經元、神經氈和細胞間隙水腫。RAE 24 h組神經元核膜結構不清,細胞器減少,線粒體腫脹、空泡化、嵴斷裂;粗面內質網擴張,常呈空泡狀,核糖體減少;高爾基復合體囊泡擴張;溶酶體較多。RAE 72 h組細胞器改變同前,但類似凋亡的細胞核較多,壞死細胞亦較其他組多見。POE 24 h組病變較RAE 24 h組輕。POE 72 h組細胞內線粒體及粗面內質網較豐富,病變亦比RAE 72 h組輕。結論POE復蘇較RAE復蘇可更能緩解缺氧致神經元超微結構的損傷、減少細胞凋亡及減輕腦水腫。提示,純氧環境對缺氧復蘇后大腦皮質神經元有一定的保護作用,并表明本動物模型適合缺氧新生大鼠大腦皮質神經元研究。

復氧;超微結構;神經元;大腦皮質;缺氧新生大鼠

新生兒窒息是嚴重的圍產醫學問題之一,它致使每年有近一百萬患兒死亡和同樣數目的嚴重后遺癥。近來隨著醫療技術的改進,高危兒存活率明顯提高,存活新生兒中樞神經系統的發病率也相應增加,早期干預可使高危兒中樞神經系統發育障礙的狀況得到改善。對低氧致缺氧性腦損傷,復氧后腦超微結構的研究報道甚少。本研究是在建立新生大鼠缺氧動物模型基礎上,分別采用純氧環境與空氣環境復蘇,應用透射電鏡觀察,比較純氧與空氣對缺氧性大腦皮質神經細胞超微結構的影響,為臨床進行新生兒窒息復氧方案及新生大鼠缺氧動物模型的建立提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組與模型制備

1.1.1 分組:取清潔級7日齡SD(Sp rague Daw ley)乳鼠20只,由南方醫科大學實驗動物中心提供【SCXK(粵)2006-0015】,體質量(12.3±1.18)g,雌雄不拘,在制成缺氧模型后,隨機分為純氧環境組(pure oxygen environm ent,POE,100%氧)(n=10)與空氣環境組(room air environm en t,RAE,21%氧) (n=10),每組再根據復氧后時間點分為2個亞組,即24 h組和72 h組,每亞組5只。

1.1.2 動物模型制作:參照經典Rice等[1]缺血缺氧動物模型制作及呂國蔚等[2]小鼠急性缺氧動物模型制作,本研究對乳鼠未行頸總動脈結扎手術操作,僅進行缺氧模型制作,首先制做透明有機玻璃密封低氧小艙,小艙體積為2 L,艙內底層置鈉石灰,以吸收二氧化碳和濕氣,兩側艙壁上下各有1個直徑2cm的小孔,分別接低氧氣瓶和排氣管道,排氣管道通入水瓶中,以保持容器內壓力與大氣一致及持續低氧狀態。實驗時,將低氧小艙置于37～38℃水中水浴,使艙內溫度控制在36℃左右,將20只乳鼠置于預熱的低氧小艙內,輸入體積分數為8%氧和92%氮的混合氣體(廣州氣體廠提供),流速為1.5 L/m in,至2.5 h時乳鼠出現明顯發紺、喘呼吸、痙攣樣動作和翻正反射難以完成,達到急性缺氧表現要求[2]。在制成缺氧模型后,立即將乳鼠分為POE組和RAE組。將POE組置于純氧艙,通入100%氧,流速為5 L/m in,艙內溫度控制在36°C左右;RAE置于同一室內空氣艙中,各30 m in。實驗結束后,放回原母鼠籠中飼養。

1.2 取材、電鏡標本制作與觀察

復氧后按時間點,將乳鼠斷頭處死,開顱,迅速在腦表面滴加預冷生理鹽水,在冰浴下取腦,快速切取丘腦段冠狀斷面(約厚3 mm)組織塊,于灰結節右側緣,按照與矢狀溝平行的方向,切取大腦半球右側額頂皮質矢狀斷面,將標本修成約1 mm3的細小組織3塊,2.5%戊二醛固定,Epon812包埋,半薄切片,甲苯胺藍染色,光鏡下定位,再修塊,取皮質第五層,作超薄切片,醋酸雙氧鈾與硝酸鉛雙重染色。在JEOL 100CX II/T型透射電鏡下觀察,重點觀察各組神經元的超微結構變化。

2 結果

復氧各組均可見神經細胞、神經氈及間隙水腫。部分神經細胞呈現不同程度的退行性病變;見少量壞死細胞和類似凋亡的細胞核,后者核固縮,核形狀不規則,染色質邊聚,核膜完整,有的形成內褶,有的突出,且含染色質,似有凋亡小體形成趨勢。

2.1 空氣環境組

2.1.1 空氣環境24 h組:可見生物膜受損,核(nuc lei,N)膜結構不清晰;細胞器減少,線粒體(m itochondria,M it)損傷明顯,腫脹,空泡化,膜局部模糊或缺失、嵴斷裂或缺失、有的甚至髓樣變;粗面內質網(rough endop las m ic reticulum,RER)擴張常呈空泡狀(圖1),核糖體減少;高爾基復合體囊泡擴張;溶酶體增多,含殘余體。

2.1.2 空氣環境72 h組:細胞器改變同上,從圖2可見神經元細胞核呈現出類似凋亡的改變,核形態不規則,形成內褶,染色質邊聚。空氣環境72 h組類似凋亡的細胞核較其他組多見。壞死細胞也較POE 72 h組多見。該組細胞周間隙仍增寬,電子密度亦低。

注:N:核;M it:線粒體;RER:粗面內質網。圖1 空氣環境24 h組Note:N:nucleus;M it:m itochond ria;RER:rough endop las m ic reticulum.F ig.1 The u ltrastructure of a neuron in a rat of the RAE 24 h group.

圖2 空氣環境72 h組F ig.2 The u ltrastructure of a neuron in a rat of the RAE 72 h group.

2.2 純氧環境組

2.2.1 純氧環境24h組:與空氣環境24 h組比含較多的線粒體,亦可見有的神經元線粒體腫脹,嵴斷裂或消失,或髓樣變;粗面內質網擴張,核糖體減少。但病變較空氣環境24 h組輕。見圖3。

2.2.2 純氧環境72 h組:從圖4可見該組細胞內線粒體及粗面內質網較空氣環境組豐富。有的神經元也見線粒體腫脹、變性,還可見較長而大的線粒體;有的粗面內質網可見輕度擴張和核糖體減少;有的仍可見高爾基復合體囊泡擴張和溶酶體。但病變比空氣環境組輕。

3 討論

注:N:核;M it:線粒體;RER:粗面內質網。圖3 純氧環境24 h組Note:N:nucleus,M it:m itochondria;RER:rough endop la sm ic reticu lum.F ig.3 The u ltrastructure of a neuron in a rat of the POE 24 h group.

注:N:核;M it:線粒體;RER:粗面內質網。圖4 純氧環境72 h組Note:N:nucleus,M it:m itochond ria;RER:rough endop la sm ic reticu lum.F ig.4 The u ltrastructure of a neuron in a rat of the POE 72 h group.

本研究選用清潔級7日齡大鼠,除保證動物健康及動物來源方便外,其腦組織結構及血液供應與人相似,更重要的是其大腦組織學發育程度與足月新生兒的大腦發育程度相似。新生兒期腦的代謝最旺盛,腦的耗氧量約占全身的一半,因此,腦缺氧時容易受損。近年來,許多學者觀察到缺氧是新生兒缺氧缺血性腦病的重要原因。蔣犁等[3]在新生大鼠腦細胞凋亡與缺氧、缺血兩因素析因研究中發現,大腦皮質缺氧比缺血效應大。有學者在體內、外實驗中,觀察到去核細胞(denuc leated cells)可誘導進行性程序性細胞死亡(凋亡);在大多數核改變前呈現細胞器高度有序的異常,例如粗面內質網腫脹、高爾基復合體水腫及線粒體破壞。提出存在不依賴于細胞核的細胞質凋亡通路[4],支持本研究結果。本實驗采用缺氧動物模型,在復氧后觀察到各組神經元、神經氈及間隙水腫;部分神經元呈現不同程度的退行性變,以細胞器改變最明顯。

3.1 復氧后線粒體改變的意義

近年來的研究發現線粒體功能障礙在缺氧缺血后神經元損傷中起關鍵作用。缺氧時有多種促凋亡級聯轉導信號整合于線粒體通透性轉變孔道(m itochond ria per m eability transition pore,M PTP), M PTP開放,線粒體跨膜電位降低,內膜通透性突然增加,Ca2+內流增加,膜間隙內存儲的大量促凋亡分子。例如細胞色素C、凋亡誘導因子和各種半胱天冬酶原等,被釋放到胞質中,引起凋亡級聯反應, DNA裂解為60 kb左右的片段,染色質異常凝集和DNA的大規模斷片化,而致神經細胞急性壞死或凋亡[5]。本研究發現新生大鼠腦缺氧復氧后,空氣環境組神經元的線粒體變性顯著,線粒體功能損傷較嚴重,致使空氣環境72 h組細胞凋亡及細胞壞死最為明顯,提示,純氧環境復蘇可能通過改善線粒體呼吸功能,促使線粒體內膜通透性趨于穩定,緩解繼發性能量衰竭,使其病變有所減輕。

3.2 復氧后內質網和高爾基復合體改變的意義

粗面內質網是一個高水平的調控系統,是蛋白質合成、修飾及折疊的重要場所,也是調節細胞應激反應的場所。Q i等[6]在小鼠缺氧30 m in后大腦皮質中觀察到缺氧造成嚴重內質網損害及ER應激引發caspase-12的增高。有報道,在缺氧缺血刺激下,大量未折疊蛋白可在內質網中堆積,導致內質網應激(endop las m ic reticu lum stress,ERS)。近來研究發現過度ERS也是一條細胞凋亡信號傳導通路。發生過度ERS啟動的細胞凋亡信號傳導通路,引起ER內Ca2+釋放,導致胞質內Ca2+穩態失衡,活化位于ER胞質面的常駐分子caspase-12,激活caspase-3而誘導凋亡[7]。另外氧自由基還可引起P53的積累,進而促進內質網釋放TNF-α和Fas,也能與DNA復制蛋白A結合,阻止DNA復制,上述效應最終激活caspase-3、6、7,促進細胞凋亡[8]。Nakagawa等[9]觀察到高爾基復合體含有促凋亡分子神經節苷脂GD 3結合位點,利于caspase-12活化,介導特異性凋亡通路。本研究純氧環境72 h組粗面內質網和高爾基復合體病變比空氣環境72 h組輕,提示,純氧環境可隨時間進程,減輕ER應激性反應和隨后的凋亡信號轉導通路,促進適應反應;促使氧應激反應的衰退等,對缺氧造成的傷害起到一定程度的緩解作用。

有報道指出在缺氧和酸中毒時,溶酶體穩定性降低,可導致溶酶體膜破裂,溶酶體酶釋放,釋放出的酸性水解酶,能直接破壞細胞本身的成分,引起細胞內消化、自溶而壞死[10]。本研究觀察到空氣環境組比純氧環境組溶酶體增多,可能是由于空氣環境組細胞器病理改變較重,激活溶酶體功能,導致自身消化能力增強。

以上不難看出,本研究純氧環境復蘇72 h對缺氧引起的新生大鼠大腦皮質神經細胞損害改善效應大于空氣環境復蘇,提示,純氧環境較空氣環境可更能緩解缺氧致神經細胞超微結構的損傷、減少細胞凋亡及減輕腦水腫,純氧環境對缺氧復蘇后大腦皮質神經元有一定的保護作用,為臨床選擇使用純氧環境或空氣環境復蘇及新生大鼠缺氧動物模型的建立提供了科學依據。

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Effects of Resusc ita tion a t 100%O xygen Env ironm en t or Room A ir Env ironm en t on the U ltrastructure of Neuron s in the Cerebra l Cor tex of Hypox ic Neona ta l Ra t

GAO Xue-Song,WANG Zi-neng
(Departm ent ofObstetrics&Gyneco logy,The FirstA ffiliated Hosp ital of Jinan University,Guangzhou 510630,China)

O b jective To compare the effects of resuscitation at pure oxygen environm ent(100%oxygen)or room air environm ent(21%oxygen)on the u ltrastructure of cerebral cortical neurons in hypoxic neonatal rat.M ethods Twenty Sp rague-Daw ley neonatal rats aged 7 days were divided into the pure oxygen environm ent(POE)and room air environm ent groups(RAE)after hypoxia,and each group was divided again into 24 h and 72 h subgroups.The pupswere p laced in an incubato r containing 8%O2to be at acute hypoxia continued for 2.5 h.The pups were reoxygenated imm ed iately after the above m entioned hypoxia.The pup s of POE group were then p laced in an incubato r containing 100% oxygen and the flow tim e was 30 m in.The pups of RAE group were reoxygenated w ith room air in an incubator for 30 m in. A cco rding to the p lanned t im e points the pup swere sacrificed and the b rain was removed at 24 h and 72 h after trea tm en t, respectively.The tissue of fron toparietal co rtex of the righ t cereb ral hem isphere was p repared fo r transm ission electron m icroscop ic exam ination.ResultsIn each reoxygenation group,edem a was found in the neurons,neurop il and in tercellu lar space.In the RAE 24 h group,the nuc learm em b rane in neu rons was unc lear,the amoun t of cell o rganelles was reduced,the m itochond ria were s wo llen w ith dam ages of cristae.The rough endop lasm ic reticulum was dilatated or vacuo lized and w ith reduction of ribosom es.The Go lgi com p lex was vacuo lized.The num ber of lysosom es was obviously increased.In the RAE 72 h group s,the changes were s im ilar to those of the fo rm er group,bu t apop to tic-like nuc lei andnecro tic neuronswere mo re frequen tly seen.The cellu lar dam ages of POE 24 h group were m ilder than those of RAE 24 h group.The m itochond ria and rough endop lasm ic reticu lum were more abundant and showed less patho logical changes in the POE 72 h group as compared w ith those of RAE 72 h group.Conc lusion The rats of POE reoxygenation disp lay m ilder ultrastructural dam ages,less apop tosis,necrosis and edem a in cerebral neurons than those in rats after RAE reoxygenation. The p rotective effect of POE resuscitation on cerebral dam age of hypoxic neonate rats is superior to that after RAE resuscitation.This hypoxic neonatal ratmodelm ay serve as a suitab le anim almodel for research on cerebral cortex neurons caused by hypoxia.

Reoxygenation;U ltrastructure;Neuron,cerebral cortex;Hypoxia;Neonatal rat

R714

A

1005-4847(2010)01-0074-04

2009-03-11

高雪松(1972-),女,碩士,暨南大學附屬第一醫院婦產科主治醫師,研究方向:圍產醫學神經生物學。E-m ail:tgxs@jnu. edu.cn