低密度脂蛋白受體相關蛋白2結合蛋白在心臟特異轉基因小鼠中引起的心臟功能代償

張麗，全雄志，董偉，王書美，張曉娟，葛文平，高珊，張連峰

(中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021)

研究報告

低密度脂蛋白受體相關蛋白2結合蛋白在心臟特異轉基因小鼠中引起的心臟功能代償

張麗，全雄志，董偉，王書美，張曉娟，葛文平，高珊，張連峰*

(中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021)

目的建立心臟特異表達的低密度脂蛋白受體相關蛋白2結合蛋白(Lrp2bp)轉基因小鼠，研究該基因在心肌病發病中的作用。方法克隆鼠源Lrp2bp基因入α－MHC啟動子下游，構建a－MHC－Lrp2bp表達載體，顯微注射法建立Lrp2bp轉基因小鼠。PCR鑒定轉基因首建鼠的基因型。Western blotting鑒定Lrp2bp在心臟中的表達，心臟超聲檢測轉基因鼠及野生型小鼠心臟結構和功能，透射電鏡觀察心肌細胞的超微結構改變。結果得到了4個Lrp2bp轉基因品系，其中3個品系心臟Lrp2bp蛋白表達量與同齡野生型鼠相比明顯增加。1 M齡轉基因小鼠與同窩陰性對照小鼠相比，心壁變厚，心腔變大，射血分數和短軸縮短率下降。結論心臟特異表達的Lrp2bp基因能引起心肌肥厚表型，可能是參與心肌代償性肥厚的基因之一。

Lrp2bp;轉基因小鼠;心臟;代償

低密度脂蛋白受體相關蛋白2結合蛋白(LDL receptor－related protein 2 binding protein，Lrp2bp)，又稱兆蛋白結合蛋白，是一種新型的具有四肽重復序列的支架蛋白，功能尚不明確，可能作為接頭分子，通過與兆蛋白結合，捕捉和釋放轉錄因子，參與轉錄調節［1］。

本實驗室建立的cTnTR92Q轉基因小鼠心臟變大，室壁變厚，心腔變小，心肌細胞排列紊亂，間質纖維化，心肌舒張功能失調［2］;cTnTR141W轉基因小鼠全心擴大，室壁變薄，間質纖維化，心肌收縮功能失調［3，4］。兩者分別表現出典型的肥厚型和擴張型心肌病病理表型。兩種疾病模型動物心臟基因表達芯片結果顯示，Lrp2bp在擴張型心肌病動物模型心肌中mRNA顯著上調表達，而在肥厚型心肌病動物模型心肌中表達較少，Lrp2bp可能參與心肌病發生發展。

1 材料和方法

1.1 材料

α－MHC Clone 26載體來自Baylor Medical College，Schinider Lab。Trizol提取液、Superscript. First－Strand Synthesis System for RT－PCR均購自Invitrogen。QIA quickGel Extraction Kit Protocol購自QIAGEN(德國)。限制性內切酶Sal I和Not I購自TaKaRa公司(日本)。所有引物由上海生工公司合成。測序由北京諾賽基因公司完成。Lrp2bp多克隆抗體、Western Blotting化學發光試劑為Santa Cruz公司(美國)產品。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋。HRP－GAPDH內參購自上海康成。C57BL/6J和ICR小鼠購自北京康藍生物技術有限公司［SCXK(京)2004－0001］。顯微注射儀為Nikon TE2000－U，倒置顯微鏡為Olympus(日本)產品。Vevo770小動物超聲探測系統購自加拿大VisualSonics公司。

1.2 RT-PCR

Trizol法提取小鼠心臟總RNA，用Superscript III reverse transcriptase試劑盒的方法將2 μg RNA用隨機引物逆轉錄合成cDNA第一鏈。跨外顯子設計Lrp2bp基因片段PCR引物，以1 μL cDNA鏈為模板進行PCR，上游引物為:5’－CTATTTTGAAGAGGGCTGGT－3’，下游引物為:5’－AATGCCAGAAAAATGCCTT－3’。PCR反應體系20 μL。反應條件:94℃預變性3 m in，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，24個循環。瓊脂糖電泳分析PCR產物，目的基因Lrp2bp片段為392 bp。

1.3 L rp2bp表達載體的構建及轉基因

提取小鼠心臟總RNA，用RT－PCR擴增小鼠Lrp2bp全長cDNA，將擴增片段插入pMD18T載體，經測序并比對正確無突變堿基后，以Sal I酶切回收Lrp2bp片段，并克隆入α－MHC啟動子下游構建心臟特異Lrp2bp表達載體，用Not I將其線性化，Sephedex G50柱純化DNA片段，注射前將轉基因片段的濃度調整至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受體，制備轉基因小鼠［5］。實驗中涉及動物的操作程序已經得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(GC－08－2032)。

1.4 PCR鑒定L rp2bp轉基因小鼠的基因型

轉基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法標記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA［6］，用PCR法對轉基因小鼠進行基因型檢測。引物及反應條件和RT－PCR相同，30個循環。

1.5 W estern blotting鑒定L rp2bp蛋白的表達

提取F1代陽性轉基因小鼠及同窩陰性小鼠的心臟總蛋白，進行SDS－PAGE凝膠電泳，將蛋白條帶轉移到0.45 μm硝酸纖維素膜上，置于5%的脫脂奶粉封閉液中，室溫1 h，加入TBST稀釋的的兔抗Lrp2bp多克隆抗體(1∶200)，4℃孵育過夜，用TBST洗膜三次，每次10 m in。然后加入1∶15 000辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫雜交1 h。采用HRP－GAPDH作為內參，棄去二抗，TBST洗膜三次，每次5 min，TBS洗膜一次，10 m in。將膜置于化學發光劑中，用X線膠片曝光。

1.6 超聲檢查Lrp2bp轉基因小鼠

選用不同月齡的轉基因陽性和同窩陰性小鼠，飽和三溴乙醇麻醉，選用30 Hz的探頭，進行心臟超聲影像分析［7］。

1.7 電鏡超微結構

取部分左心室心臟組織固定于2.5%戊二醛(PBS，pH 7.4)固定液中，1%鋨酸固定1 h，梯度乙醇脫水，環氧樹脂Epon 812包埋。乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后在透射電鏡下觀察，數碼相機拍攝圖片。

2 結果

2.1 RT-PCR驗證基因芯片結果

本室3月齡cTnTR92Q和cTnTR141W轉基因小鼠心臟總RNA的全基因表達芯片(Mouse Expression Array430 sets)，結果顯示，Lrp2bp在兩種轉基因小鼠心臟中表達差異較大，故采用RT－PCR方法進行驗證(圖1)。

2.2 L rp2bp基因在野生小鼠組織的表達譜

提取一月齡野生小鼠心、肝、脾、肺、腎和腦六種組織總蛋白，Western blotting分析Lrp2bp在各組織中的表達。結果顯示，Lrp2bp主要在成年小鼠腎臟組織中表達，肝、脾中表達較高，心、肺和腦組織中表達量少(圖2)。

2.3 L rp2bp表達載體的構建

用RT－PCR法克隆的Lrp2bp基因，測序結果表明克隆的cDNA同已報道Lrp2bp序列完全一致(GenBank No.NM_026278)，將Lrp2bp基因插入心臟特異表達的α－MHC啟動子的下游，構建Lrp2bp轉基因表達載體(圖3)。

2.4 轉基因小鼠基因表型的鑒定

用顯微注射法將線性化的轉基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉入到假孕受體ICR小鼠中，小鼠出生后9～14 d提取基因組DNA，用PCR檢測Lrp2bp轉基因小鼠(圖4)，共得到4只首建鼠，均可傳代。

圖2 Lrp2bp在1月齡野生小鼠不同組織中的表達Fig.2 The expression of Lrp2bp gene in different tissues of wild type mice aged 1 month

圖3 αMHC－Lrp2bp表達載體的構建Fig.3 The construction of αMHC－Lrp2bp vector

2.5 L rp2bp基因在轉基因小鼠心臟中的表達

提取4個首建鼠一月齡F1代轉基因小鼠和同窩陰性小鼠心臟組織總蛋白，用Western blotting分析Lrp2bp基因的表達。結果顯示，Lrp2bp基因在1、3和6三個轉基因品系的心臟組織中高表達(圖5)。

注:P:以轉基因質粒為模板的陽性對照;N:陰性對照;H2O:空白對照;M:DL2000 DNA分子量標記;1～7:為轉基因鼠的DNA樣品。圖4轉基因小鼠的PCR鑒定Note:P is αMHC－Lrp2bp p lasmid used as positive control;N is the negative control;H2O is water as the blank control;M is DL2000 DNA marker;1－7 are genomic DNA samples from the transgenic mice.Fig.4 Genotyping of the transgenic mice by PCR

2.6 超聲檢查

注:WT是野生型對照，Tg 1、Tg 3、Tg 6和Tg 7是4個轉基因陽性品系。圖5 Lrp2bp基因在首建鼠F1代小鼠心臟中的表達Note:WT is wild type mice control;Tg 1，3，6 and 7 a re the trangenic lines.Fig.5 The expression of Lrp2bp gene in the heart of transgenic mice

1、3月齡Lrp2bp轉基因小鼠和同窩陰性小鼠進行心臟超聲影像分析(表1)，結果顯示，1月齡Lrp2bp轉基因小鼠收縮期和舒張期左室前壁厚度(LVAW)分別增加20%和14%。收縮期左室內徑(LVID，systolic)增加16%，舒張期左室內徑(LVID，diastolic)增加9%，射血分數(EF%)和短軸縮短率(FS%)分別降低8%和10%;3月齡轉基因小鼠心臟收縮期左室前壁厚度增加16%，舒張期左室前壁厚度增加22%，其他監測指標與野生對照小鼠相比無顯著差異。

上述數據表明，Lrp2bp轉基因小鼠出生后即心腔擴大，心壁變厚，心功能下降，但是隨月齡增長，病理表型逐漸消失。表明Lrp2bp基因表達對心臟發育及心肌病發生發展起到一定的調節作用。

表1 1、3月齡Lrp2bp和野生型小鼠M超聲參數的獨立樣本t檢驗(±s)Tab.1 Independent samples T test of wild type and Lrp2bp transgenic mice aged 1 and 3 months(±s)

表1 1、3月齡Lrp2bp和野生型小鼠M超聲參數的獨立樣本t檢驗(±s)Tab.1 Independent samples T test of wild type and Lrp2bp transgenic mice aged 1 and 3 months(±s)

注:*P＜0.05，**P＜0.01;野生型，n=16;Lrp2bp轉基因，n=18.Note:*P＜0.05，**P＜0.01;W ild type，n=16;Lrp2bp tg mice，n=18.

年齡(月) Age (month)組別Group收縮期左室前壁LVAW，s (mm)舒張期左室前壁LVAW，d (mm)收縮末期左室內徑LVESD (mm)舒張末期左室內徑LVEDD (mm)射血分數(%) EF (%)短軸內徑縮短率(%) FS(%) 1月齡One month野生型Wild type 1.02±0.1 0.63±0.1 1.93±0.3 3.25±0.2 76.17±5.1 44.10±4.9轉基因Lrp2bp tg 1.23±0.1**0.77±0.1**2.24±0.3**3.54±0.2**70.06±7.8*39.27±6.3*3月齡Three months野生型W ild type 1.05±0.1 0.68±0.06 2.65±0.3 3.84±0.3 62.46±6.2 33.38±4.5轉基因Lrp2bp tg 1.25±0.3*0.83±0.10*2.65±0.6 3.84±0.3 64.26±14.1 35.63±10.9

2.7 電鏡超微結構

6月齡小鼠心臟的透射電鏡顯示，野生小鼠的心肌纖維排列規則，結構清晰;而Lrp2bp轉基因小鼠的心肌纖維肌小節變長，Z帶變窄，肌漿網輕度擴張(圖6)。

注:A，野生鼠;B，Lrp2bp轉基因鼠。肌小節長度(雙向箭頭)，肌漿網(箭頭)，線粒體(白色星星)。圖6 6月齡小鼠左心室電鏡圖Note:A:W ild type mice.B:Lrp2bp tg mice.The double headed arrow indicates sarcomere length.The arrowhead indicates sarcoplasmic reticulum.The white star indicates mitochondria.Fig.6 Respresentative transmission electron micrographs of the cardiomyocytes in the left ventricle wall from mice aged 6 months

3 討論

低密度脂蛋白受體相關蛋白2(LDL receptorrelated protein 2，Lrp2)是近年來發現的一種細胞表面蛋白，屬于一種內吞性受體，是低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)基因家族七大成員之一。Lrp2除了參與內吞作用外，還具有細胞信號傳導功能。Lrp2bp作為與Lrp2結合的一種新型接頭分子，可能通過與受體相互作用，招募各種蛋白分子形成蛋白復合體，介導受體參與信號轉導。酵母雙雜交實驗揭示，與Lrp2bp結合的蛋白分子可以分為兩大類:轉錄調節子如ski作用蛋白(SKI－interacting protein)和信號轉導成分包括蛋白激酶Cα結合蛋白(PRKCABP)和促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)等。然而，Lrp2和Lrp2bp相互作用的分子機制及參與的具體生理過程還有待于闡明［1］。

人低密度脂蛋白受體相關蛋白2結合蛋白在各種組織和器官中廣泛表達，在人子宮、睪丸、小腸、結腸、血液白細胞及人胰腺癌細胞系中表達水平較高［8，9］。本研究中Lrp2bp基因小鼠組織表達譜顯示，Lrp2bp主要在成年小鼠腎臟中表達，在心臟中也有少量表達。mRNA水平上，Lrp2bp在擴張型心肌病模型小鼠心臟中表達較高，提示Lrp2bp在心臟發育及心肌病發生發展中起到重要作用。

目前關于Lrp2bp基因功能的研究較少，更沒有和心肌病之間聯系的相關報道。本研究建立的Lrp2bp轉基因小鼠心臟功能及幾何構型與野生型小鼠相比發生了顯著變化，表明Lrp2bp基因的表達可能在心肌病發生發展中起到一定的調節作用。由于機體自身的代償作用，使這種表型隨月齡增長而逐漸消失，因此我們將用Lrp2bp轉基因小鼠與轉基因擴張型心肌病和肥厚型心肌病小鼠雜交，進一步研究Lrp2bp在心肌病發病中的作用，為心肌病的機制研究和治療提供線索。

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Com pensation Effect of L rp2bp on the Heart Function in the Heart Tissue Specific Transgenic M ice

ZHANG Li，QUAN Xiong－zhi，DONG Wei，WANG Shu－mei，ZHANG Xiao－juan，GE Wen－ping，GAO Shan，ZHANG Lian－feng*
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，and Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo generate heart tissue specific Lrp2bp transgenic mouse and to study its effects on cardiomyopathy.M ethods The transgenic plasmid was constructed by inserting the murine Lrp2bp gene into the downstream of α－MHC promoter.The transgenic mice were created by microinjection.The genotype of transgenic line was identified by PCR and the expression level of the gene was determined by Western blotting.The cardiac function and geometry were detected by echocardiography.The ultrastructural changes of cardiomyocytes from Lrp2bp transgenic mice were observed by transmission electron microscopy.Results Three lines of C57BL/6J transgenic mice with high level of Lrp2bp expression were identified from four transgenic founders.At 1 month old，the Lrp2bp transgenic mice showed increased thickness of the ventricular wall，dilated ventricular chamber，decreased ejection fraction and decreased fractional shortening compared with that of wild type mice.ConlusionTransgenic mice with cardiac tissue specific Lrp2bp gene have been established successfully and Lrp2bp caused compensation effect on the cardiomyopathy in the transgenic mice.

Lrp2bp;Transgenic mouse;Heart;Compensation

R349.6

A

1005－4847(2010)02－0131－05

2009－12－17

衛生部項目，實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501－026)。

張麗，女，博士研究生，E－mail:zhangliqq2004@126.com

張連峰，Tel:86－010－87778442;E－mail:Zhanglf@cnilas.org