自然發情與誘導發情小鼠子宮內膜中雌激素受體α表達的比較

高雅，林自力，張鴻波，梁鴻斌，劉云海，郭勇，倪和民

(北京農學院動物科學技術系，北京 102206)

研究報告

自然發情與誘導發情小鼠子宮內膜中雌激素受體α表達的比較

高雅，林自力，張鴻波，梁鴻斌，劉云海，郭勇，倪和民

(北京農學院動物科學技術系，北京 102206)

目的從雌激素受體α(ERα)的角度探討自然發情小鼠與誘導發情小鼠的子宮內膜上，雌激素受體α表達是否受內源雌激素的特異誘導而變化，兩者之間是否存在差異。方法27只同日齡母鼠，根據處理方式的不同隨機分為3個組:自然發情假孕組(對照組)、誘導發情處理假孕組和自然發情假孕第1天摘除卵巢組，3個組的小鼠在見栓后第4、6、8天分別取樣后，采用免疫組織化學法觀察小鼠子宮內膜中雌激素受體α的表達情況。結果免疫組化結果顯示，3個處理組的小鼠子宮內膜上皮細胞核、胞質都有ERα存在，且主要表達在腺上皮;見栓第4、6、8天時，誘導發情處理組小鼠子宮內膜的ERα陽性率均顯著高于自然發情組和自然發情第1天摘除卵巢組(P＜0.05);見栓第8天時，自然發情處理組小鼠子宮內膜中的ERα陽性率與自然發情第1天摘除卵巢組差異不顯著(P＞0.05)，但見栓第4、6天時兩者陽性率差異顯著，自然發情處理組小鼠子宮內膜中的ERα陽性率顯著高于自然發情第1天摘除卵巢組(P＜0.05)。結論誘導發情處理的小鼠子宮內膜，其表面雌激素受體α表達顯著高于自然發情小鼠，且兩者都受其內源性雌激素的特異誘導而變化。

小鼠;子宮內膜;雌激素受體α;免疫組織化學

哺乳動物的早期胚胎著床是一個復雜的過程，當胚胎著床時，母體子宮內會分泌一些特殊蛋白以確保順利著床［1］，著床成功與否與胚胎正常發育、子宮內膜的容受性及適宜的內分泌環境密切相關［2］。雌激素是一種類固醇激素，主要在卵巢中合成，可以導致子宮內膜在形態和生理方面的改變，從而影響子宮的容受性，保證胚胎的順利著床。一般認為雌激素是通過和細胞內特異性雌激素受體(estrogen receptor，ER)結合，從而引發啟動轉錄等一系列下游事件，產生生理學效應［3］，所以比較子宮內膜上ER的表達變化對探討改善動物子宮的受容性有重要意義。

目前已知的雌激素受體有兩種，分別是ERα和ERβ，表達在不同動物卵巢、睪丸、乳腺、小腦等組織上。通過基因敲除顯示:ERα敲除小鼠(αERKO)是高度不育的，這種小鼠的子宮發育不正常，子宮基質組織結構松散且發育不良［4－5］。而ERβ敲除小鼠(βERKO)雖然能生育，但是幼仔個體數目少且體型也較小［6］，說明ERβ對小鼠胚胎著床的影響并不是很大，但可能對著床后的胚胎發育有直接影響。

目前已經有人通過免疫組化的方法研究了不同動物不同組織上兩種ER受體分布表達變化的情況，但針對同期發情處理后與自然發情小鼠子宮中ERα和ERβ的相應差異變化研究卻未見報道。此外，由于在正常小鼠胚胎著床時子宮中的ERβ受體作用不明顯，所以在此不對其進行研究。有鑒于此，本研究擬針對以上實際存在的問題，從ERα的角度探討同期發情處理后，這些受體在小鼠子宮內膜與自然發情同一時期小鼠的子宮內膜上的分布表達是否存有差異，同時結合分析ERα的相應分布是否受其內源性雌激素的特異誘導，從而為提高體外受精胚胎移植妊娠率提供必要的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:本實驗選用ICR系小鼠，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司，動物許可證號為SCXK(京)2002－2003。母鼠為8周齡，體重28 g左右;公鼠8～24周齡，體重35 g左右。

1.1.2 實驗試劑:ERα兔單克隆抗體(Epitomics，1115－1);抗兔SABC試劑盒、3，3－二氧基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢市博士德生物工程公司);磷酸緩沖液(PBS)自配。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組:將27只母鼠隨機分為3個組:①自然發情假孕組(對照組):選擇陰門淡粉紅色的雌性青年鼠按1∶1的比例與成年結扎公鼠合籠過夜交配，次日早8:00檢查交配情況。見陰道栓者即可以用于實驗并以見栓當日記為妊娠1 d。②同期發情處理假孕組:于實驗開始的當天19:00，選擇陰門淡粉紅色的雌性青年鼠，每只腹腔注射PMSG 10 IU，間隔46 h，于隔天的17∶00腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)每只15 IU。注射hCG后按1∶1的比例與成年結扎公鼠合籠過夜交配，次日早8:00檢查交配情況。見陰道栓者即可以用于實驗。③自然發情假孕第1天摘除卵巢組:選擇陰門淡粉紅色的雌性青年鼠按1∶1的比例與成年結扎公鼠合籠過夜交配，次日早8∶00檢查交配情況。見陰道栓者于9∶00在麻醉條件下切除雙側卵巢即可用于實驗。

1.2.2 樣本采集:3個處理組見栓后的小鼠，分別于見栓后第4、6、8天隨機各選取3只，處死后取出子宮，生理鹽水沖洗，4%的多聚甲醛4℃浸漬固定48～96 h。

1.2.3 免疫組化SABC法操作程序:①常規石蠟包埋、切片;②切片脫蠟至水，3%H2O2室溫30 m in以滅活內源性酶PBS沖洗一下;③0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原熱修復，PBS洗3次;④5% BSA在37℃作用40 min;⑤一抗兔抗ER多抗(1∶50)4℃過夜，PBS洗3次;⑥生物素化羊抗兔IgG在37℃孵育30 min，PBS洗3次;⑦滴加SABC 37℃30 m in，PBS洗4次;⑧DAB顯色5 m in;⑨蘇木素復染、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。

陰性對照以0.01 mol/L的PBS液代替⑤中的一抗，其余步驟同上。

1.2.4 圖像分析:將子宮內膜細胞按照子宮腺上皮細胞、子宮腔上皮細胞和子宮內膜基質細胞三種細胞類型分別計數:隨機選取5張切片，每張切片隨機觀察5個視野，取5個視野的細胞陽性表達率(陽性細胞/細胞總數)均值。

1.2.5 統計方法:實驗數據采用DPS數據處理軟件單因素方差，Duncan檢驗分析，數據相關分析結果采用平均數±標準誤(±s)表示。

2 結果與分析

2.1 小鼠子宮內膜中ER表達分布

免疫組化染色陽性切片背景無色或淡藍色，ER免疫反應物質為黃色或棕黃色;陽性細胞的胞質和胞核中著有黃色或棕黃色反應顆粒，陰性細胞的細胞核被蘇木素染成淡藍色或藍色。對照組切片染色陰性，背景無色或淡藍色，無黃色或棕黃色染色，說明免疫組化SABC法具有ER免疫反應的特異性。見圖1(封三)，箭頭所指為陽性反應物。

2.2 小鼠子宮內膜中ER的陽性率變化

2.2.1 各處理組子宮內膜腺上皮細胞中ERα在見栓第4、6、8天陽性率的變化:見表1。

表1 各處理組子宮內膜腺上皮細胞中ERα在見栓第4、6、8天陽性率的變化(陽性百分比)(±s)Tab.1 The intensity of ERα expression in glandular epithelium(The rate of positive staining)(±s)

表1 各處理組子宮內膜腺上皮細胞中ERα在見栓第4、6、8天陽性率的變化(陽性百分比)(±s)Tab.1 The intensity of ERα expression in glandular epithelium(The rate of positive staining)(±s)

注:上標相同字母表示差異無顯著性(P＞0.05)，字母不同表示差異有顯著性(P＜0.05)。Note:The same letters indicate non－significant differences among them(P＞0.05).The different letters indicate a significant difference among them(P＜0.05).

組別Group第4天Day 4第6天Day 6第8天Day 8自然發情假孕組Natural estrus pseudocyesis 0.54194±0.0499b0.36280±0.0814b0.44777±0.1317b同期發情處理假孕組Estrus synchronization and pseudocyesis 0.71983±0.0738a0.64532±0.1083a0.77763±0.0407a自然發情假孕第1天摘除卵巢組Natural estrus，pseudocyesis and being ovariectomized at the first day of estrus 0.29302±0.2182c0.22226±0.0761c0.31469±0.1744b

從表1可以看出:同期發情處理假孕組小鼠子宮內膜腺上皮細胞ER陽性率在見栓第4、6、8天均顯著高于自然發情組和自然發情假孕第1天摘除卵巢組(P＜0.05)。自然發情假孕第1天摘除卵巢組在見栓的第8天與自然發情假孕組差異無顯著性，但第4、6天時則顯著低于自然發情組(P＜0.05)。

2.2.2 各處理組子宮內膜腔上皮細胞中ERα在見栓第4、6、8天陽性率的變化:在該實驗中，只在自然發情第6天和誘導發情第6天的小鼠子宮內膜腔上皮上檢測到ER的表達，其余各組均未檢測到ERα的表達。

2.2.3 各處理組子宮內膜腺基質細胞中ERα在見栓第4、6、8天陽性率的變化:在該實驗中，未檢測到子宮內膜腺基質細胞中有ER的表達。

3 討論

ER在小鼠子宮內膜中的分布是受雌激素調節的。經典的雌激素作用模式是與雌激素受體結合，通過靶基因上游的雌激素反應元件調控靶基因的轉錄，這種機制被稱為雌激素的基因組作用模式，需要雌激素與ER形成復合體后轉移至細胞核才能發揮作用［7］。然而，隨著研究的不斷深入，也有研究表明除經典的基因組作用模式外，雌激素還存在非基因組作用模式，這種作用模式不需要雌激素進入細胞核，而是通過分布于細胞膜的雌激素結合蛋白，激活細胞內信號級聯放大反應［7］。因此，雌激素受體既表達于胞核中，也表達于胞質和細胞膜上。本實驗中，在各處理組的細胞質和細胞核中均可檢測到ERα，說明ERα通過激活不同的信號途徑介導了不同的調控作用。

本實驗選擇在見栓后的第4、6、8天檢測ERα，主要是因為小鼠胚胎著床通常發生在見栓后的第4天，此時小鼠體內的E2分泌會達到一個高峰，通過觀察幾個不同處理組的小鼠子宮內膜中ER的表達分布情況，從而可以比較幾組處理小鼠子宮中ER在胚胎著床前后的表達分布是否存在差異。本實驗中設有一自然發情假孕第1天摘除卵巢組，目的在于雌激素主要在卵巢中合成，摘除卵巢后可以觀察到小鼠子宮內膜中的ERα是否受到來自卵巢的內源性雌激素的影響。從結果可以看出，自然發情假孕第1天摘除卵巢組小鼠子宮內膜中的ERα陽性率在見栓第4、6天時均顯著低于另外兩組，且在見栓第8天仍顯著低于誘導發情組，這說明不同處理方法的小鼠子宮內膜中ERα在胚胎著床前后的表達存在差異。此外，自然發情假孕第1天摘除卵巢組的小鼠可能是由于摘除卵巢后缺少了內源性雌激素，使得ERα的表達下降，從而可以推測小鼠子宮內膜中ERα的分布受到內源性雌激素的特異誘導而變化。另外，本實驗中的誘導發情采用了PMSG +hCG的組合，由于PMSG半衰期較長，在體內不容易及時清除，從而會影響卵泡的發育和及時排卵，繼而產生不能排卵的大卵泡，而大卵泡可分泌雌二醇，造成胚胎著床前后一段的時期內外周血液中E2水平較高［8－9］，從而影響子宮內膜中ERα的表達，因此推斷可能內源性雌激素對子宮內膜中ER的表達具有上調作用。

本實驗中，在各處理組的腺上皮中都檢測到了ERα的存在，這說明ERα影響子宮腺體的發育，與前人研究的ERα敲除小鼠的子宮腺體數量少相一致。但是在子宮內膜基質上并沒有檢測到ERα的存在，這與張翼海［10］及連艷［11］的結果相一致，但與Bruce等的結果不一致，他們在正常女性子宮內膜的基質細胞中也檢測到ERα的存在［1］。另外，本實驗也只在見栓第6天的自然發情組和同期發情組的小鼠子宮內膜腔上皮檢測到ERα，因此推測可能在見栓后不同時期，由于雌激素的影響，ERα通過激活不同定位的信號途徑來介導調控作用。

綜上所述，同期發情處理和自然發情的小鼠在胚胎著床階段其子宮內膜上的ERα分布是存有明顯差異的，這可能會進一步影響胚胎著床的過程以及胚胎移植的妊娠率。

(本文圖1見封三。)

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Com parison of the Expression of Estrogen Receptor α in M ouse Endom etrium between Those Treated by Estrus Synchronization and in Natural Estrus

GAO Ya，LIN Zi－li，ZHANG Hong－bo，LIANG Hong－bin，LIU Yun－hai，GUO Yong，NI He－m in (Department of Animal Science＆Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China)

ObjectiveTo investigate the distribution of estrogen receptor α(ERα)in the endometrium between the m ice treated by estrus synchronization and in natural estrus，and analyze whether such kind of ERα distribution is solely induced by endogeneous estrogen.M ethods According to the different treatments，total 27 ICR mice were divided into three groups:(1)the group in natural estrus and pseudocyesis(the control group)，(2)the group treated by estrus synchronization and pseudocyesis，(3)the group in natural estrus，pseudocyesis and being ovariectomized at the first day of estrus.ResultsThe results of immunohistochem istry showed that the estrogen receptor α distributed in both nucleus and cytoplasm，and ERα mainly expressed in glandular epithelium(GE).On day 4，6，8，the positive staining cell number in the estrus synchronization group was much higher than those of natural estrus(P＜0.05).On day 8，the positive staining cell number in the group of natural estrus and pseudocyesis and being ovariectomized at the first day of estrus，was not significantly different(P＞0.05)，but on Day 4 and 6，these data of the natural estrus group were significantly higher than those of the pseudocyesis one being ovariectomized at the first day of estrus(P＜0.05).ConlusionThe expression of ERα in mouse uterine endometrium by estrus synchronization is much higher than that of the natural estrus one.The ERαdistribution is mainly induced by their endogeneous estrogen.

Mouse;endometrium;estrogen receptor α;immunohistochemistry

R321－33

A

1005－4847(2010)02－0168－04

2010－02－22

北京市自然基金重點項目“胚胎滋養層干細胞的功能性分析”(項目批準號:5091002)，國家“十一五”“863計劃”重點項目“家畜卵泡高效誘導發育技術研究與應用”(項目批準號:2008AA101003)，國家“十一五科技支撐計劃”項目“肉羊高效育種關鍵技術的研究與應用”(項目批準號:2008BADB2B04－4)。

高雅(1984－)，女，北京人，碩士研究生，研究方向:產科及胚胎工程。

倪和民，男，副教授;研究方向:動物產科及胚胎工程E－mail:nihemin@yahoo.com.cn