二氫葉酸還原酶基因在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用

孫淑娜，桂永浩，蔣璆，錢林溪，宋后燕

研究報告

二氫葉酸還原酶基因在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用

孫淑娜1，桂永浩1，蔣璆2，錢林溪2，宋后燕2

(1.復旦大學附屬兒科醫(yī)院，上海 201102;2.復旦大學分子醫(yī)學教育部重點實驗室，上海 200032)

目的觀察二氫葉酸還原酶基因(DHFR)功能阻抑斑馬魚胚胎的顱腦部發(fā)育情況，初步探討二氫葉酸還原酶基因在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用。方法采用顯微注射嗎啡啉修飾的反義核苷酸(MO)的方法進行DHFR表達阻抑。胚胎發(fā)育至受精后48 hpf觀察胚胎的顱部發(fā)育情況，在60 hpf時經(jīng)石蠟切片進一步觀察胚胎的腦發(fā)育狀況。利用胚胎整體原位雜交的方法檢測影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵因子ngn1和huc的表達情況。結(jié)果顯微注射MO可成功的進行DHFR表達阻抑。DHFR表達阻抑組胚胎存在顱腦部發(fā)育明顯異常和ngn1、huc的表達強度明顯減弱，且與顯微注射的MO劑量呈正相關(guān)。結(jié)論DHFR在斑馬魚顱腦發(fā)育中有重要作用;其功能阻抑可導致胚胎顱腦部發(fā)育異常，其機理與ngn1和huc的的表達減弱有關(guān)。

二氫葉酸還原酶基因;神經(jīng)系統(tǒng);斑馬魚

葉酸是一種十分重要的維生素，其可通過轉(zhuǎn)運一碳單位而對嘌呤、嘧啶、核酸、蛋白質(zhì)的合成以及細胞的分裂和生長有重要作用。如果孕早期婦女體內(nèi)葉酸生物學活性發(fā)揮受抑制，會影響胎兒大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，并導致神經(jīng)管缺陷［1］。神經(jīng)管是胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前身，可分化為腦和脊髓;神經(jīng)管缺陷是一組累及顱骨、腦和脊椎的常見而嚴重的先天異常，是導致圍生兒死亡的主要原因之一。近年來研究顯示葉酸對于胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育十分重要［2，3］，孕婦在胚胎發(fā)育早期補充葉酸能有效預防胎兒發(fā)生神經(jīng)管畸形［4，5］。二氫葉酸還原酶(DHFR)是葉酸發(fā)揮生物學作用過程中的重要因子，其功能被阻抑可造成生物體內(nèi)葉酸缺乏的模式［6］。本實驗在新興模式生物斑馬魚中開展;觀察二氫葉酸還原酶基因(DHFR)功能阻抑對顱腦發(fā)育以及對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育重要因子ngn1和huc表達的影響;為探尋DHFR在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用提供依據(jù)，也期望為臨床上治療和預防葉酸缺乏導致的胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷提供線索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

野生型斑馬魚(AB系)購自美國Oregon大學，養(yǎng)殖系統(tǒng)從美國Aquatic Habitats公司引進［7］。受精卵置于孵化液(60 μg/m L海鹽)28°C孵化，出絨毛膜后在胚胎培養(yǎng)液內(nèi)養(yǎng)育，每天更換胚胎培養(yǎng)液。受精卵按照Kimmel等［8，9］描述對發(fā)育階段分期，用于原位雜交的胚胎受精后24 hpf(24 hours post fertilization)始用0.003%苯硫脲(PTU)處理以防止黑色素的形成。

1.2 主要實驗試劑

構(gòu)建基因探針及原位雜交所用試劑主要購自Promega公司、美國羅氏公司、Takara公司。Realtime PCR所用SYBR Green熒光染料購自美國羅氏公司。

1.3 DHFR表達阻抑以及阻抑效率驗證

阻抑DHFR表達的MO(morpholino oligonucleotides，嗎啡啉修飾的反義核苷酸)以及Con MO由美國GENE TOOLS公司設(shè)計以及合成。共設(shè)計并合成兩個阻抑DHFR表達的MO，每個MO都可特異性的作用于翻譯起始位點ATG附近，阻斷DHFR的翻譯(圖1 A)。將MO1與MO2(兩個不同的嗎啡啉修飾的反義核苷酸)同時進行顯微注射以增加DHFR表達阻抑的可靠性。DHFR MO1:5’－ACGGTCTCGCCTTCTTCCCGCCAAG－3’，DHFR MO2:5’－CAGTTAACAAGTCACGCTGGCTACT－3’;對照MO:5’－CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA－3’，DHFR MO以及對照MO溶解于30%的Danieau溶液中。注射劑量為MO I(MO1 2.5 ng+MO2 2.5 ng)，MO II(MO1 5 ng+MO2 5 ng)，每組注射50枚胚胎，實驗重復3次。

在驗證顯微注射DHFR MO可使DHFR表達阻抑，我們構(gòu)建了pT7TS－DHFR-GFP(綠色熒光蛋白基因)融合質(zhì)粒，其在胚胎體內(nèi)可轉(zhuǎn)錄DHFR-GFP融合蛋白(圖1 B)。DHFR-GFP融合質(zhì)粒被稀釋液稀釋為60 μg/m L(溶液:0.1%酚紅，0.2 mol KCl，pH= 7.0)。將1～2個細胞期的受精卵分為3組，每組50枚胚胎，分別顯微注射8 nL DHFR-GFP(綠色熒光蛋白)融合質(zhì)粒、8 nL DHFR-GFP融合質(zhì)粒+6 nL DHFR MO I以及8nL DHFR-GFP融合質(zhì)粒+6nL DHFR MO II。在8 hpf于熒光顯微鏡下觀察各組胚胎的GFP表達情況。若DHFR MO成功阻抑DHFR表達，GFP(綠色熒光蛋白)的生成將明顯減少(圖1 C)。每組注射50枚胚胎，每組重復3次實驗。

圖1 DHFR功能阻抑以及阻抑效率驗證的示意圖Fig.1 The sketch maps of DHFR inhibition and verification of the inhibition effects.

1.4 基因探針制備及胚胎整體原位雜交

抽提斑馬魚胚胎48hpf總RNA后，經(jīng)RT－PCR逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增特異性基因序列作為原位雜交的探針片段。將PCR產(chǎn)物切膠回收，連接入PGEM－T載體中，經(jīng)測序驗證后，獲得含有ngn1以及huc cDNA片段的質(zhì)粒。利用內(nèi)切酶將其線性化后，體外轉(zhuǎn)錄反義RNA探針(地高辛標記)。胚胎的固定及原位雜交按照已完善的步驟進行［10，11］。進行原位雜交時每組20枚胚胎，實驗重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計應用spss11.5軟件，均值之間的差異顯著性用雙側(cè)t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 顯微注射DHFR MO可阻抑DHFR的表達

8 hp f時熒光顯微鏡下進行觀察的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DHFR-GFP融合質(zhì)粒注射組胚胎有較強的GFP表達(圖2 A，D)，DHFR-GFP融合質(zhì)粒+DHFR MO I注射組胚胎(44.6±4.16)(圖2 B，E)以及DHFRGFP融合質(zhì)粒+DHFR MO II注射組胚胎(45.0± 2.00)(圖2 C，F(xiàn))的GFP表達明顯減弱。此結(jié)果說明顯微注射DHFR MO可使DHFR表達阻抑。圖2見彩插6。

2.2 葉酸缺乏對腦發(fā)育影響的形態(tài)學觀察

光鏡下對各組胚胎48 hpf頭顱部發(fā)育的觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Con MO注射組胚胎的頭顱部發(fā)育正常(圖3 A)，各DHFR MO注射組存在兩種頭顱發(fā)育異常表型，分別為頭顱增大水腫(圖3 B)以及頭顱發(fā)育不良，體積減小(圖3 C)。對各DHFR MO注射組胚胎進行頭顱部發(fā)育狀況進行統(tǒng)計的結(jié)果表明，隨MO注射劑量的增加，頭顱發(fā)育異常的發(fā)生率增加，頭顱增大水腫表型的比例下降而頭顱發(fā)育不良的比例上升。圖3見彩插6。

2.3 葉酸缺乏對腦發(fā)育影響的石蠟切片觀察

將Con MO注射組胚胎、DHFR MO注射組頭顱增大水腫胚胎以及頭顱發(fā)育不良胚胎在60 hpf進行固定后制作成蠟塊。進行切片后顯微鏡下對腦組織結(jié)構(gòu)進行觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，頭顱增大水腫胚胎的腦體積較Con MO注射組胚胎(圖3 D)減小，且腦細胞排列稀疏(圖3 E);頭顱發(fā)育不良胚胎的腦體積較頭顱增大水腫胚胎進一步縮小，腦細胞不僅排列稀疏，且細胞體積亦減小(圖3 F)。圖3見彩插6。

2.4 葉酸缺乏對ngn1以及huc表達的影響

利用胚胎整體原位雜交的方法對ngn1以及huc表達情況檢測的結(jié)果表明，在Con MO中，ngn1以及huc在腦部和脊髓有較強表達(圖4 A，D;圖5 A，D)。與Con MO組相比，ngn1以及huc在DHFR MO I注射組胚胎的腦部和脊髓的表達強度下降(圖 4 B，E;圖5 B，E);ngn1以及huc在DHFR MO II注射組中的表達強度較DHFR MO I注射組進一步減弱(圖4 C，F(xiàn);圖5 C，F(xiàn))。圖4，5見彩插7。

3 討論

在本實驗中，我們采用顯微注射嗎啡啉修飾的反義核苷酸(MO)的方法進行基因表達阻抑。顯微注射MO已被證實是一種簡單、有效的阻抑目的基因功能的方法［12－14］。如圖1中A所示，實驗中所用于使DHFR表達阻抑的DHFR MO I以及DHFR MO II可特異的作用于靶基因的翻譯起始位點ATG附近的5’－UTR區(qū)，阻斷DHFR的翻譯從而達到阻抑DHFR表達的目的。如圖1中B所示，含有5’－UTR序列的DHFR-GFP質(zhì)粒可同時表達DHFR以及GFP，而DHFR MO I以及DHFR MO II可作用于5’－UTR區(qū)阻斷DHFR-GFP融合質(zhì)粒的翻譯(如圖1C所示)。因此在熒光顯微鏡下所觀察到的GFP表達情況與DHFR的表達水平一致。在我們的實驗中我們利用此點進行了DHFR表達阻抑的效率驗證。我們發(fā)現(xiàn)DHFR-GFP融合質(zhì)粒注射組胚胎有較強的GFP表達，而DHFR-GFP融合質(zhì)粒+DHFR MO I以及DHFR-GFP融合質(zhì)粒+DHFR MO II注射組中GFP表達明顯減弱，說明顯微注射DHFR MO可有效的使DHFR表達阻抑。

在光鏡下以及進行石蠟切片觀察DHFR MO I以及DHFR MO II注射組胚胎的顱腦部發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)胚胎的顱腦部發(fā)育嚴重程度與顯微注射的MO劑量正相關(guān);顯微注射的劑量越大，顱腦部發(fā)育不良以及腦細胞數(shù)量和體積減少胚胎的比例越高。為了初步探尋DHFR功能阻抑導致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的機理，我們檢測了DHFR功能阻抑胚胎中ngn1以及huc的表達情況。ngn1屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，是表達于腦以及脊髓的重要神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育調(diào)節(jié)因子之一［15，16］。在脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，ngn1對于中胚層細胞向神經(jīng)細胞分化［17］、神經(jīng)系統(tǒng)細胞的形成和成熟［18］、大腦皮層的發(fā)育［19］等十分關(guān)鍵。huc屬于RNA結(jié)合蛋白家族，對于神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育十分重要，在神經(jīng)分化和成熟過程中扮演重要角色［20，21］，其可通過增加mRNA的穩(wěn)定性而對神經(jīng)細胞的功能有維持作用［22］。通過原位雜交的方法對ngn1以及huc表達情況檢測的結(jié)果表明，DHFR MO注射組胚胎中ngn1以及huc的表達強度明顯減弱，且其減弱程度與DHFR MO注射劑量呈正相關(guān)。

本實驗研究表明，DHFR功能阻抑可導致胚胎顱腦發(fā)育明顯異常，并造成ngn1以及huc的表達強度明顯減弱。DHFR可能通過影響ngn1以及huc的表達而對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有調(diào)節(jié)作用。

(本文圖2、3見彩插6，圖4、5見彩插7。)

［1］De Marco P，Calevo MG，Moroni A，et al.Polymorphisms in genes involved in folate metabolism as risk factors for NTDs［J］. Eur J Pediatr Surg，2001，11(Suppl 1):S14－17.

［2］Black MM.Effects of vitamin B12 and folate deficiency on brain development in children.Food Nutr Bull［J］，2008，29(Suppl 2):S126－131.

［3］Bagnyukova TV，Powell CL，Pavliv O，et al.Induction of oxidative stress and DNA damage in rat brain by a folate/methyldeficient diet［J］.Brain Res，2008，1237:44－51.

［4］Czeizel AE.Periconceptional folic acid and multivitamin supplementation for the prevention of neural tube defects and other congenital abnormalities［J］.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2009，85(4):260－268.

［5］Bower C，D＇Antoine H，Stanley FJ.Neural tube defects in Australia:trends in encephaloceles and other neural tube defects before and after promotion of folic acid supp lementation and voluntary food fortification［J］.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2009，85(4):269－273.

［6］Sun SN，Gui YH，Wang YX，et al.Effects of methotrexate on the development of heart and vessel in zebrafish.Acta Biochim Biophys Sinica［J］，2009，41(1):86－96.

［7］張立鳳，鐘濤，桂永浩.外源性視黃酸對斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響［J］.中國實驗動物學報，2006，14(2):84－88.

［8］Westerfield M.A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)［M］.The Zebrafish Book.Eugene OR:Univ.of Oregon Press，3.1，3.26，3.1－4.6.

［9］Kimmel CB，Ballard WW，Kimmel SR，et al.Stages of embryonic development of the zebrafish［J］.Dev Dyn，1995，203(3):253－310.

［10］Berdougo Coleman EH，Lee DH，et al.Mutation of weak atrium/ atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish［J］.Development，2003，130:6121－6129.

［11］侯佳，桂永浩，等，視黃酸缺乏對斑馬魚心臟房室分化的影響［J］.中國實驗動物學報，2007，15(5):365－368.

［12］Sun SN，Gui YH，Wang YX，et al.Effect of dihydrofolate reductase gene knock－down on the expression of heart and neural crest derivatives expressed transcript 2 in zebrafish cardiac development［J］.Chin Med J(Engl).2007，120(13):1166－1171.

［13］Heasman J.Morpholino oligos:making sense of antisense?［J］Dev Biol，2002，243(2):209－214.

［14］孫淑娜，桂永浩，錢林溪，等.葉酸缺乏對斑馬魚背主動脈發(fā)育影響的實驗研究［J］.中國實驗動物學報，2008，16 (5):321－324.

［15］Nieber F，Pieler T，Henningfeld KA.Comparative expression analysis of the neurogenins in Xenopus tropicalis and Xenopus laevis［J］.Dev Dyn，2009，238(2):451－458.

［16］Nakada Y，Parab P，Simmons A，et al.Separable enhancer sequences regulate the expression of the neural bHLH transcription factor neurogenin 1［J］.Dev Biol，2004，271(2): 479－487.

［17］Kim SS，Yoo SW，Park TS，et al.Neural induction with neurogenin1 increases the therapeutic effects of mesenchymal stem cells in the ischemic brain.Stem Cells［J］.2008，26(9): 2217－2228.

［18］Raft S，Koundakjian EJ，Quinones H，et al.Cross－regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development［J］. Development，2007，134(24):4405－4415.

［19］Wang L，Zhang ZG，Zhang RL，et al.Neurogenin 1 mediates erythropoietin enhanced differentiation of adult neural progenitor cells［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26(4):556－564.

［20］Hinman MN，Lou H.Diverse molecular functions of Hu proteins［J］.Cell Mol Life Sci，2008，65(20):3168－3181.

［21］Diks SH，Bink RJ，van de Water S，et al.The novel gene asb11:a regulator of the size of the neural progenitor compartment［J］.J Cell Biol，2006，174(4):581－592.

［22］Zhu H，Hasman RA，Barron VA，et al.A nuclear function of Hu proteins as neuron－specific alternative RNA processing regulators［J］.Mol Biol Cell，2006，17(12):5105－5114.

Effects of Dihydrofolate Reductase Gene on the Developm ent of Nervous System in Zebrafish

SUN Shu－na1，GUI Yong－h(huán)ao1，JIANG Qiu2，QIAN Lin－xi2，SONG Hou－yan2
(1.Children’s Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China; 2.Department of Molecular Genetics，Shanghai Medical College and Key Laboratory of Molecular Medicine，Ministry of Education，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032)

Objective To observe the development of cranium and brain in dihydrofolate reductase gene－inhibited zebrafish embryos and to investigate the mechanism of action of dihydrofolate reductase gene(DHFR)in this process.MethodsDHFR was inhibited by microinjecting morpholino oligonucleotides(MO).The development of heads at 48 hours post fertilization(48 hpf)was observed and the development of the brain at 60 hpf was exam ined by histopathology. Whole－mount in situ hybridization was performed to detect the expression of ngn1 and huc，which are two key factors in the developments of nervous system.ResultsDHFR was successfully inhibited by microinjecting MO.The abnormal developments of heads and brains were observed in DHFR-inhibited embryos.Compared with controls，the expressions of ngn1 and huc were reduced in DHFR-inhibited groups.With the increasing doses of MOs，the malformations were more severe and the reduction of ngn1 and huc expressions was more pronounced.ConlusionDHFR plays a major role in the development of nervous system in zebrafish.The malformation of cranium and brain induced by DHFR-inhibition was related with the decreasing expression of ngn1 and huc.

dihydrofolate reductase gene，nervous system，zebrafish

Q3，Q7

A

1005－4847(2010)02－0127－04

2009－05－06

國家教育部博士點基金資助(編號:200802461111)。

孫淑娜(1978－)，女，醫(yī)師，研究方向:先心病的發(fā)病機理研究。E－mail:shunasun@163.com

桂永浩。E－mail:yhgui@shmu.edu.cn