復健片對大鼠腦梗死后不同時間點Nogo－A表達的影響

胡懷強，周永紅，馬學盛，王新陸

(1.中國人民解放軍濟南軍區總醫院神經內科，濟南 250031;2.青島大學醫學院，青島 266071; 3.山東中醫藥大學，濟南 250355)

研究報告

復健片對大鼠腦梗死后不同時間點Nogo－A表達的影響

胡懷強1，周永紅2，馬學盛3，王新陸3

(1.中國人民解放軍濟南軍區總醫院神經內科，濟南 250031;2.青島大學醫學院，青島 266071; 3.山東中醫藥大學，濟南 250355)

目的觀察復健片在不同時間點對腦梗死大鼠腦組織Nogo－A表達的影響，探討其促進神經發生的作用機制。方法240只SD大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型組和藥物組共四個大組，并根據腦梗死病程每組又分為3 d、1周、2周、4周、6周共5個亞組，每個亞組動物數為12只。用改良的Longa EZ法制備大腦中動脈阻塞大鼠模型，藥物組灌胃給予復健片水溶液，余各組分別灌胃給予同劑量的蒸餾水。用免疫組織化學法觀察模型大鼠梗死周邊區腦組織Nogo－A的表達。結果模型組大鼠腦內的Nogo－A在梗死后即開始表達，逐漸增高，2周時達到高峰，第6周時還處于高表達狀態，明顯高于正常對照組。3 d時藥物組中Nogo－A的表達與模型組比較差異無顯著性(P＞0.05)，其余各藥物組中Nogo－A表達與模型組比較均有非常顯著性差異(P＜0.01)。結論復健片可抑制Nogo－A的表達，從而促進神經再生。

復健片;腦梗死;神經再生;抑制因子;Nogo－A

腦梗死后神經功能重塑的因素十分復雜，包括促進因素和抑制因素，能否有效解除抑制效應是中樞神經再生的關鍵［1］。Nogo－A是目前發現的最為強烈的神經纖維再生抑制物質，抑制損傷神經發生，尤其是再生神經纖維的長距離生長［2］。研究表明［3］，滋補肝腎的中藥復健片可明顯改善中風患者神經功能評分，可促進中樞神經再生作用，本研究首次通過給予復健片，觀察局灶性腦缺血模型大鼠不同時間點腦組織中Nogo－A含量的變化，探討復健片在腦梗死后腦功能重塑中的作用機制。

1 材料方法

1.1 動物和分組

成年SPF級雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠240只，體重250～300 g，由山東中醫藥大學實驗動物中心提供［SCXK(魯)20050015］，并于本動物中心動物實驗設施進行無菌手術，檢疫后備用，自由攝食進水。顆粒大鼠飼料，由濟南康大飼料與山東省實驗動物中心聯合生產［魯飼準字364號］。動物管理嚴格按照中華人民共和國科技部實驗動物管理規范，使用的3R原則給予人道的關懷。大鼠隨機分為:正常對照組、假手術組、模型組和藥物組共四個大組，并根據腦梗死病程每組又分為3 d、1周、2周、4周、6周共5個亞組，每個亞組動物數為12只。

1.2 藥物與試劑

復健片，主要藥物為何首烏、草決明、桑寄生、海馬、淫羊藿等，由山東魯信藥業有限公司生產，批號: 2007030701，并按照成人劑量的20倍［9 g/(kg·d)］將其制成水溶液，濃度為0.9 g/m L(即1 mL/100 g)，置于4℃冰箱中備用。Nogo－A單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 大腦中動脈阻塞(M CAO)模型的制備

在Longa等［4］報道的方法基礎上改良后行MCAO術制作局灶性腦缺血模型。MCAO模型成功的判斷標準采用Longa EZ評分標準［4］:0分，無神經缺損表現;1分，對側前爪不能充分伸展;2分，向外側轉圈;3分，行走時向對側傾倒;4分，不能行走，意識喪失。動物清醒后進行神經功能評分，1至3分者為納入標準，0分和4分者剔除。

1.4 給藥方法

于造模成功24 h后給藥，藥物組灌胃給予復健片水溶液1 m L/100 g，余各對照組分別灌胃給予1 m L/100 g劑量的蒸餾水，每日1次，每周連續給藥6 d，停1 d，并于取材當天停藥。固體飼料和水自由攝取。各組均是每天給藥1次，每3 d稱體重1次，重新計算每只動物藥量，直至取材時。

1.5 標本制備

在取材的各時間點，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛PBS灌注固定取腦，然后將其浸于4%多聚甲醛中后固定。常規脫水浸蠟包埋，予正中隆起水平在切片機上行4 μm連續冠狀切片。

1.6 免疫組織化學染色

切片常規脫蠟至水;30%H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫10 min以滅活內源性酶，蒸餾水洗3次;熱修復抗原:將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)，電爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后，反復1次，自然冷卻后用PBS(pH 7.2～7.6)洗滌2次;滴加5%BSA封閉液，室溫20 m in，甩去多余液體，不洗;滴加兔抗鼠Nogo－A一抗(1∶50)，4℃過夜，PBS(pH 7.2～7.6)洗2 m in×3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃20 m in。PBS (pH 7.2～7.6)洗2 min×3次;滴加試劑SABC，37℃20 m in，PBS(pH 7.2～7.6)洗5 m in×4次; DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒，室溫顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。免疫組織化學染色陰性對照用生物素化山羊抗兔IgG代替一抗，其余步驟同上，以檢查Nogo－A免疫反應的特異性。

1.7 圖像分析

切片在統一放大倍數下，在大腦梗死區周圍隨機選10個視野，運用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統進行分析，記錄平均陽性細胞數。

1.8 統計學方法

所得數據經正態分布及方差齊性檢驗后進行單因素方差分析，數據用SAS8.1版統計軟件進行分析，所用計量資料均采用±s(均數±標準差)表示。

2 結果

各組大鼠MCAO術后Nogo－A蛋白表達的變化，見表1。

表1 不同時間點各組大鼠Nogo－A表達(±s)Tab.1 Expression of Nogo－A in all experimental groups at different stages

表1 不同時間點各組大鼠Nogo－A表達(±s)Tab.1 Expression of Nogo－A in all experimental groups at different stages

注:與同時間點正常對照組比較:☆☆t=－9.95，P＜0.0001;△△t=－17.02，P＜0.0001;▲▲t=－20.74，P＜0.0001;▽▽t=－12.25，P＜0.0001;▼▼t=－9.48，P＜0.0001。與同時間點的模型組比較，☆t=－1.63，P=0.1210＞0.05;△t=6.23，P＜0.0001;▲t=9.74，P＜0.0001;▽t=8.52，P＜0.0001;▼t=9.05，P＜0.0001。Note:Compared with the normal control group at the same stage:☆☆t=－9.95，P＜0.0001;△△t=－17.02，P＜0.0001;▲▲t=－20.74，P＜0.0001;▽▽t=－12.25，P＜0.0001;▼▼t=－9.48，P＜0.0001.Compared with the model group at the same stage:☆t=－1.63，P=0.1210＞0.05;△t=6.23，P＜0.0001;▲t=9.74，P＜0.0001;▽t=8.52，P＜0.0001;▼t=9.05，P＜0.0001.

時間點stage正常對照組Normal control假手術組Sham operation模型組Model藥物組Medicine 3 days 9.54±1.49 9.75±1.88 18.15±2.47☆☆20.00±2.57☆1 week 8.56±1.34 8.32±1.26 24.69±2.98△△17.63±1.33△2 weeks 8.76±1.37 8.90±2.25 30.33±3.26▲▲19.31±1.91▲4 weeks 9.50±3.43 9.57±2.20 27.32±3.09▽▽14.86±3.03▽6 weeks 10.10±2.18 8.96±2.66 20.69±3.05▼▼10.67±1.96▼

Nogo－A免疫陽性產物呈棕黃色，在胞質中表達。研究結果表明，正常對照組和假手術組大鼠腦組織中的抑制因子Nogo－A處于較低的表達狀態，且在各時間點沒有明顯的變化，且二者之間差異無顯著性(P＞0.05)。模型組大鼠腦內的Nogo－A在梗死后即開始表達，逐漸增高，于2周時達到高峰，然后逐漸降低，至第6周時還處于高表達狀態，明顯高于正常對照組，且各時間點Nogo－A的表達與正常對照組比較差異有非常顯著性(P＜0.01)。說明神Nogo－A在腦梗死后較快的表達，在恢復期達到高峰，并在后遺癥期還處于高表達狀態，可見在腦梗死后各期Nogo－A均參與神經再生抑制。藥物組大鼠梗死后腦內的Nogo－A表達增高，其中，3d藥物組中Nogo－A的表達與模型組比較差異無顯著性(P＞0.05)，其余各藥物組中Nogo－A表達與模型組比較差異均有非常顯著性(P＜0.01)，說明復健片能有效解除神經再生抑制。

3 討論

早在1928年，Cajal就認為中樞神經系統再生失敗的主要原因不是發出神經纖維的神經元的缺陷，而是缺乏適合的微環境［5］。大量研究認為神經生長抑制因子的存在是中樞神經系統難以有效再生可能的原因，怎樣棄除或減輕抑制因素對神經軸突再生的抑制作用是目前研究的重點。目前相繼發現了數個具有抑制軸突再生的因子，美國加州大學Goldberg等［6］認為Nogo基因的發現是“探索脊髓損傷和卒中病人治療漫長道路中的一個里程碑”，其中Nogo－A具有最強的抑制神經生長的作用，并通過多位點的相互作用激活NgR啟動神經細胞內的信號轉導通路，抑制軸突再生和結構的重塑性［7］。Nogo－A是CNS髓鞘磷脂神經元軸突生長抑制因子，是一個主要在少突膠質細胞的胞體和突起表達的膜蛋白，其兩個結構域在抑制軸突生長方面發揮著協同作用［8］，在CNS中提供限制神經纖維延長的生長環境，它在體內和體外都顯示出了抑制神經軸突生長的作用［9，10］。在腦損傷后，Nogo－A可以抑制軸突再生［11］，而拮抗Nogo－A后所獲得的再生神經纖維是有功能性的，并能形成有功能的突觸聯系［12］。因此，Nogo－A在具有高度可塑性的大腦區域的神經元回路塑型過程中具有顯著的抑制作用，如不能有效解除抑制效應，中樞神經再生難以達到有效的康復水平。

近年來的研究證實，中藥可以誘導中樞神經系統產生有利的微環境促進神經再生，但這些研究均是從促進神經生長正性調節因子表達的角度來探討中藥的作用機制，而對能否下調抑制因素的表達，促進缺血后重塑，鮮有報道。

中醫認為，腦梗死的主要病機是機體在各種病理因素作用下，機體陰陽失調，肝腎陰精受損，風火痰氣血等病理產物旋而變生，在各種誘因作用下引發而致。其病機關鍵為肝腎陰虛，肝腎陰虛成于中風之先，是腦梗死發病的根本，已病之后貫穿于腦梗死的整個病理過程，且在其發展演變和治療過程中往往進一步傷耗陰津。故宜采用滋補肝腎法治療腦梗死，復健片正是根據此法而設，由何首烏、淫羊藿、海馬等組成，具有調補肝腎之效，補腎以填精生髓，補肝以養春生之木氣，助腎生髓，肝腎并補，意在加強生髓以充腦。復健片是王新陸教授的經驗方，由制何首烏、桑寄生、草決明、海馬、淫羊藿等五味藥組成。何首烏為君藥，能滋補肝腎，養血益精。桑寄生為補腎補血要劑，且偏走于肢體筋脈;草決明，既有滋陰補肝腎之功，又有清肝熱熄肝風之效，二味同有滋補肝腎之功，共扶何首烏固本培源，是為臣藥。海馬能補元陽、調和氣血，淫羊藿有補命門肝腎，能壯陽益精之效，二味皆為性溫之品，溫則行，一防滋膩;二可激發腎氣，和調陰陽;三有通行氣血之用，故稍佐此二味。諸藥合用，共奏滋補肝腎，益精補髓之功。

研究結果表明，Nogo－A免疫陽性產物呈棕黃色，在胞質中表達。正常對照組和假手術組大鼠腦組織中的抑制因子Nogo－A一致處于較低的表達狀態。梗死后大鼠腦梗死區周圍的Nogo－A即開始表達，并逐漸增高，于2周時達到高峰，然后逐漸降低，至第6周時還處于高表達狀態，明顯高于正常對照組，與正常對照組比較差異有非常顯著性(P＜0.01)。說明Nogo－A始終參與中樞神經再生。復健片干預的藥物組在3 d時與模型組之間Nogo－A表達差異無顯著性，其余各時間點藥物組與模型組比較差異均有非常顯著性(P＜0.01)，說明復健片不能在短時間內顯著抑制Nogo－A表達，可能是由于中藥起效緩慢所致。1周后復健片組大鼠腦梗死區周圍的Nogo－A表達受到顯著抑制。研究結果表明復健片可通過抑制神經生長負性調控因子的表達，解除中樞神經再生的抑制，從而發揮促進腦梗死后的神經發生的作用，這也可能是中藥促進腦梗死患者臨床康復的機制之一。

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Effect of a Traditional Chinese M edicine，“Fujian Tablet”，on Nogo-A Exp ression in Brain Tissue of Rats w ith Cerebral In farction at Different Stages

HU Huai－qiang1，ZHOU Yong－hong2，MA Xue－sheng3，WANG Xin－lu3
(1.Department of Neurology，Jinan M ilitary Region General Hospital，Jinan 250031，China;2.Department of Traditional Chinese Medicine，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266071; 3.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355)

ObjectiveTo observe the effect of a traditional Chinese nedicine，“Fujian tablet”，on the expression of Nogo－A in brain tissue of rats with cerebral infarction at the different stages，and to explore its mechanism on neural regeneration.M ethods Two hundred and forty healthy male Sprague－Dawley rats were random ly divided into 4 groups: normal control，sham operation，model and medicine groups，which were random ly divided into five subsets(n=12)at 3 d，1 w，2 w，4 w and 6 w stages after cerebral infarction，respectively.The rat models with middle cerebral artery occlusion were successfully established by an improved Longa EZ procedure.Fujian tablet was dissolved in water and given to the rats of treatment groups by gastric gavage，while the other groups received distilled water.The expression of Nogo－A in the brain tissue around the infarction was detected by immunohistochem istry.ResultsNogo－A expression was observed at a short period after cerebral infarction in the model group，and increased gradually，reached a peak at 2 weeks and was still positive at 6 weeks after infarction.The differences between model and normal control groups were significant at the same stage(P＜0.01).The difference between medicine group and model group was not significant(P＞0.05)at 3 days，but significant(P＜0.01)at other stages.ConlusionThe Fujian tablet can promote neurogenesis by inhibiting theexpression of Nogo－A.

Fujian tablet;Cerebral infarction;Neural regeneration;Inhibiting factor;Nogo－A

R－255

A

1005－4847(2010)02－0118－04

2009－08－10

國家自然科學基金(編號:30672745);山東省科學技術發展計劃(編號:2006GG3202005)

胡懷強(1978－)，男，山東臨沂人，臨床醫學博士，博士后，主要從事中西醫結合治療神經系統疾病的基礎與臨床研究。E－mail:huhuaiqiang@126.com，TEL:013156189722