影響野生型Canton S果蠅睡眠時間的相關生理因素

李廷利，許光輝，徐瑞鑫

(黑龍江中醫藥大學藥學院，哈爾濱 150040)

研究報告

影響野生型Canton S果蠅睡眠時間的相關生理因素

李廷利，許光輝，徐瑞鑫

(黑龍江中醫藥大學藥學院，哈爾濱 150040)

目的探討影響果蠅睡眠時間的相關生理因素。方法選擇野生型Canton S果蠅為實驗對象，利用果蠅活動監測系統(DAMS)，以5 min為單位自動統計一次果蠅活動次數，若5 m in內活動次數為零，認為果蠅處于睡眠狀態，計為果蠅的睡眠時間，累積計算果蠅24 h睡眠總時間為指標，分別觀察了日齡(7日齡)相同，而性別不同和性別(雌性)相同，而日齡(2，7，12，17，22，27和32日齡)不同果蠅的24 h睡眠總時間。結果①同一日齡(7日齡)不同性別的果蠅之間白天(12 h)及夜間(12 h)平均睡眠時間的長短存在著顯著差異。雌果蠅白天(12 h)平均睡眠時間短于雄果蠅，而夜間(12 h)平均睡眠時間長于雄果蠅。雌果蠅白天(12 h)平均睡眠時間顯著短于夜間平均睡眠時間(P＜0.05);而雄果蠅白天(12 h)平均睡眠時間與夜間(12 h)平均睡眠時間基本持平。②同一性別(雌性)不同日齡的果蠅，隨著日齡的增加，其白天(12 h)平均睡眠時間有逐漸縮短的趨勢，27日齡的果蠅睡眠時間減少相對明顯，32日齡果蠅的睡眠時間有所恢復，相互之間存在著顯著差異(P＜0.05)。夜間(12 h)平均睡眠時間有逐漸延長的趨勢，27日齡果蠅的夜間平均睡眠時間有所減少，32日齡果蠅的夜間平均睡眠時間相對有所恢復，相互之間存在著顯著差異(P＜0.05)。結論性別與日齡等生理因素對果蠅24 h睡眠時間有顯著的影響。

果蠅;睡眠時間;睡眠節律;果蠅活動監測儀

果蠅具有清晰的遺傳背景;簡約的神經系統;較短的生命周期;較強的繁殖能力;豐富的行為菜單和方便的基因操作等生物學特性，以往其作為一個經典的模式生物在遺傳學等研究領域廣泛應用。近十年來，大量研究結果表明，果蠅具有哺乳動物共有的睡眠生物特征［1］，將其作為模式生物應用于睡眠及睡眠發生機制的研究［2－4］。

為了利用果蠅這一模式生物開展睡眠有關方面的研究，我們對影響果蠅睡眠時間的相關生理因素進行了實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:野生型Canton S品系黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)由北京大學生命科學學院提供。

1.1.2 果蠅培養基:蒸餾水460 g，玉米粉42 g，蔗糖31 g，瓊脂3 g，酵母粉3 g，丙酸3 m L。

1.1.3 實驗儀器:果蠅群體活動監測系統(DAMS，美國Trikinetics公司)，該系統由果蠅活動監測器與數據采集分析軟件組成。

1.2 方法

1.2.1 實驗環境:溫度:(24±1)℃;濕度:50%～60%;光照:12 h自動亮－暗循環(7:00開燈，19:00關燈)。

1.2.2 果蠅睡眠監測方法:將實驗果蠅轉入細小玻璃管(內徑5 mm，長6.5 cm，一端內裝有果蠅的培養基并用石蠟或黑色小帽封住，另一端用棉球封住)內，每只小管裝一只果蠅。然后將細小玻璃管嵌入到果蠅活動監測器上。一個監測器可同時監測32只果蠅，監測器直接連在計算機上，監測器發出紅外光束橫穿細小玻璃管中部，果蠅每次從玻璃管中部經過時阻斷紅外光束，計算機自動記錄1次，DAM系統數據采集軟件每隔5 min自動記錄一次果蠅活動次數。若持續5 min以上活動次數記錄為零，即果蠅靜止時間持續5 min以上時，此休息狀態符合睡眠行為標準，認為果蠅處于睡眠狀態［5］。在實驗12 h前，將果蠅裝入小管內適應環境。

1.2.3 性別對果蠅睡眠時間的影響:收集12 h內羽化的果蠅，雌雄分開飼養，隨機分布選擇7日齡的雌雄果蠅32只，移入到果蠅睡眠監測管(于監測前適應12 h)中，對雌雄果蠅分別進行活動監測，按上述果蠅睡眠判斷標準，計算其總睡眠時間。同一實驗重復3次。

1.2.4 日齡對雌果蠅睡眠時間的影響:收集12h內羽化的果蠅，雌雄分開飼養，隨機分別選擇2、7、12、17、22、27日齡和32日齡的雌果蠅各32只，移入果蠅活動監測管(于監測前適應12 h)中，對不同日齡的果蠅分別進行活動監測，計算其睡眠總時間。同一實驗重復3次。

1.2.5 數據處理與分析:通過EXCEL軟件對實驗數據進行處理。以時間為橫坐標，以實驗果蠅每小時睡眠時間(單位:分鐘/小時)的平均值為縱坐標繪圖。采用SPSS13.0分析軟件，不同類型的數據先通過正態分布檢驗，各組數據符合正態分布，進行LSD法分析。

2 結果

2.1 性別對果蠅睡眠時間的影響

實驗結果見圖1和表1。

圖1 7日齡果蠅睡眠節律變化Fig.1 The changes of sleep and awake in 7－day－old drosophila

表1 7日齡雌、雄果蠅平均睡眠時間比較(±s，min/h)Tab.1 Comparison of the average sleep time between 7－day－old male and female dosophila(±s，min/h)

表1 7日齡雌、雄果蠅平均睡眠時間比較(±s，min/h)Tab.1 Comparison of the average sleep time between 7－day－old male and female dosophila(±s，min/h)

注:同日齡(7日齡)的雌、雄果蠅在白天和夜晚的平均睡眠時間相比較，*為P＜0.05;同日齡(7日齡)的雌和雄果蠅在白天或夜晚的平均睡眠時間相比較，△△為P＜0.01。*Represents P＜0.05，comparison of the average sleep time between 7－dayold male and female dosophila;△△represents P＜0.01，comparison of the average sleep time of day and night in 7－day－old male or female dosophila.

性別Gender白天平均睡眠時間Average sleep time of day夜晚平均睡眠時間Average sleep time of night雌Female 14.4±11.7*△△42.6±15.3雄Male 36.1±20.6 38.5±17.0

實驗結果表明，同一日齡(7日齡)不同性別的果蠅之間白天(12 h)平均睡眠時間的長短存在著顯著差異。雌果蠅白天(12 h)平均睡眠時間短于雄果蠅(P＜0.01)。雌果蠅白天(12 h)平均睡眠時間顯著短于夜間平均睡眠時間(P＜0.05);而雄果蠅白天(12 h)平均睡眠時間與夜間(12 h)平均睡眠時間基本持平。

2.2 日齡對雌果蠅睡眠時間的影響

實驗結果見圖2(彩插4)、圖3和表2。

實驗結果表明:同一性別(雌性)不同日齡的果蠅，隨著日齡的增加，其白天(12 h)平均睡眠時間有逐漸縮短的趨勢，27日齡的果蠅睡眠時間減少相對明顯，32日齡果蠅的睡眠時間有所恢復，相互之間存在著顯著差異(P＜0.05)。夜間(12 h)平均睡眠時間有逐漸延長的趨勢，27日齡果蠅的夜間平均睡眠時間有所減少(P＜0.05)，32日齡果蠅的夜間平均睡眠時間相對有所恢復。

圖3 不同日齡雌果蠅平均睡眠時間Fig.3 The average sleep time during the day and night with age in female drosophila

表2 不同日齡雌果蠅睡眠時間的變化(±s，min/h)Tab.2 The changes of sleep time in female drosophila of different ages(±s，min/h)

表2 不同日齡雌果蠅睡眠時間的變化(±s，min/h)Tab.2 The changes of sleep time in female drosophila of different ages(±s，min/h)

注:不同日齡果蠅與7日齡果蠅的白天(12 h)或夜間(12 h)平均睡眠時間相比較(LSD檢驗)，*為P＜0.05.*Represents P＜0.05 vs.7－day－old drosophila(One－way ANOVA，LSD test).

日齡Day白天平均睡眠時間Average sleep time during the day夜晚平均睡眠時間Average sleep time during the night 2 21.4±9.1*39.1±9.4 7 14.4±11.7 42.6±15.3 12 18.4±11.3 47.3±8.9 17 15.6±13.6 45.4±10.9 22 13.2±4.5 46.1±10.0 27 8.7±3.2 31.1±9.2*32 12.8±2.4 35.8±6.1

3 討論

睡眠是一個基本的生物學過程，涉及有機體的功能和對不斷變化的外界環境的反應。

果蠅作為睡眠研究的模式生物關鍵在于它是否具有真正意義上的睡眠。在哺乳動物和鳥類，睡眠的判定是直觀的，通過腦電、肌電、眼電等電生理現象可以區分其清醒和睡眠兩種狀態。然而對于無脊椎動物，由于缺乏產生腦電的神經結構，所以只能通過行為標準去界定它們是否存在睡眠狀態。

目前界定睡眠的行為學標準［2，6］:靜止時間的延長;具有特定的姿勢和休息的位置;激醒反應閾的提高;在外界刺激下可快速可逆;具有內穩態調節——睡眠剝奪后對睡眠需求的增加［7］;具有晝夜節律性。用這些標準研究果蠅發現，果蠅在它類似睡眠的休息狀態下，表現出對輕微的刺激沒有反應。它們在行為學實驗中表現出活動減少和喚醒閾值提高，大多數果蠅距離食物1 mm、背對著食物的方向靜止不動，僅腹部有一定的呼吸，散在鼻動或是極少數出現四肢震顫和抽搐，果蠅每天都保持這種睡眠狀態很長時間［8］，并且主要的休息時間發生在黑夜的前半夜。但是在較大的刺激下，可以被喚醒。當睡眠被剝奪(手動或自動)后，果蠅會代償性增加睡眠時間，第二天它們表現出休息需要的增加和一個明顯的代償式休息延長，表現出內穩定調節。如同哺乳動物一樣睡眠回跳發生在睡眠剝奪結束時，相對于短時剝奪(6 h)，長時剝奪(12～24 h)更為顯著，恢復的睡眠僅僅是它被剝奪時間的一個片段［9］。這種自我平衡穩態的睡眠行為反彈與睡眠損失有關，與刺激的停止無關。

隨著果蠅活動監測系統的應用，果蠅的睡眠狀態得以監測、睡眠時間得以量化。早期應用超聲活動監測儀進行果蠅睡眠行為的監測，但是這種方法只能對一只果蠅進行連續的、高分辨率的監測。目前普遍采用自動紅外監測儀(DAMS)來監測果蠅的睡眠行為和計算果蠅的睡眠時間，其可以同時監測多只果蠅的睡眠時間。DAMS監測系統包括監測器和數據采集分析系統。

經過大量研究，得出了一致結論:果蠅靜止時間持續5 min以上，此狀態符合睡眠行為標準。因此，利用DAMS監測，果蠅靜止不動長于5 m in時，被定義為果蠅處于睡眠狀態［3，10］，并以此計算其24 h的總睡眠時間。

本研究以野生型Canton S果蠅為觀察對象，利用DAMS系統，觀察了性別與日齡對果蠅睡眠時間的影響，研究結果提示我們，在今后利用果蠅這一模式生物開展睡眠研究時，要充分考慮到相關生理因素對果蠅睡眠時間的影響。

(本文圖2見彩插4。)

［1］Hendricks JC，Finn SM，Panckeri，KA，et al.Rest in drosophila is a sleep－like state［J］.Neuron.2000，25(1):129－138.

［2］Hendricks JC，Sehgal A，Pack AI.The need for a simple animal model to understand sleep［J］.Prog Neurobiol，2000，61(4): 339－351.

［3］Greenspan RJ，Tononi G，Cirelli C，et al.Sleep and the fruit fly［J］.Trends Neurosci，2001，24(3):142－145.

［4］Sheeba V，Fogle KJ，Kaneko M.Large ventral lateral neurons modulate arousal and sleep in Drosophila［J］.Curr Biol，2008，18(20):1537－1545.

［5］Andretic R，P.J.Shaw PJ.Essentials of sleep recordings in Drosophila:moving beyond sleep time［J］.Methods Enzymol，2005，393:759－772.

［6］Campbell S，Tobler I.Animal sleep:a review of sleep duration across phylogeny［J］.Neurosci Biobehav Rev，1984，8:269－300.

［7］Tobler I.Effect of forced locomotion on the rest－activity cycle of the cockroach［J］.Behav Brain Res.1983，8:351－360.

［8］Ho KS，Sehgal A.Drosophila melanogaster:an insect model for fundamental studies of sleep［J］.Methods Enzymol.2005，393: 772－793.

［9］X Huber R，Hill SL，Holladay C，et al.Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster［J］.Sleep.2004，27:628－639.

［10］Shaw PJ，Cirelli C，Greenspan RJ，et al.Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster［J］.Science，2000，287.: 1834－1837.

Effects of Gender and Age in Days on the Sleep Rhythm of Drosophila melanogasters

LI Ting－li，XU Guang－hui，XU Rui－xin
(Pharmaceutical College，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Haerbin 150040，China) Corresponding author:LI Ting－li

ObjectiveTo exp lore the physiological factors affecting the sleep duration of Drosophila melanogaster.M ethods Canton－S wild type Drosophila was chosen as the experimental object，and the sleep duration of Drosophila was determined by an infrared activity monitoring system(DAMS).Sleep was defined as any period of uninterrupted behavioral immobility lasting longer than 5 minutes.All the immobility time was counted together as the sleep duration during 24 hr.Drosophila of the same age(7－day old)and different genders，as well as of the same gender (female)and different ages(2，7，12，17，22，27 and 32－day old)were observed during a 24 hr－day to make a comparison of their sleep duration.Results①There was a significant difference between 7－day old males and females，either in day－time(12 hr)or in the night－time(12 hr).Female drosophila had a shorter sleep duration in day－time(12 hr)than that of males，while it was longer than that of males in night－time(12 hr).On the other hand，the females slept significantly less in day－time(12 hr)than in night－time(12 hr)(P＜0.05)compared with the males.②A long with the increasing of age，the sleep duration became much longer in female drosophila.But there was a tendency that sleep period during day－time becoming shorter，especially in 27－day－old drosophila.When the age reached up to 32 days，the sleep period was relatively recovered.All those changes had a significant difference(P＜0.05)between each other.Similarly，27－day－old drosophila had a less sleep duration in night－time which was recovered to a certain extent in 32－day drosophila，while the average sleep period in night－time was somehow increasing.We also derive significant difference(P＜0.05)inthese discrepancy.ConlusionGender and age and other physiological factors significantly affect the sleep time of flies during 24 hr.

Drosophila melanogaster;Sleep time;Sleep rhythm;DAMS

Q－331

A

1005－4847(2010)02－0105－04

2009－09－28

國家自然科學基金面上項目(編號:30672634)。

李廷利，教授，男，漢族，黑龍江哈爾濱人，醫學博士，博士生導師，主要從事天然藥物及復方生物活性的研究。Email: litingli8888@sohu.com