益腎解毒通絡湯對糖尿病大鼠腫瘤壞死因子-α的影響

金英花，南 征

(1.廣東藥學院附屬第一醫院，廣東廣州 510080；2.長春中醫藥大學第一附屬醫院，吉林長春 130021)

益腎解毒通絡湯對糖尿病大鼠腫瘤壞死因子-α的影響

金英花1，南 征2

(1.廣東藥學院附屬第一醫院，廣東廣州 510080；2.長春中醫藥大學第一附屬醫院，吉林長春 130021)

目的：觀察益腎解毒通絡湯對實驗性糖尿病腎病的影響。方法：以鏈脲菌素誘導的糖尿病大鼠為動物模型，經益腎解毒通絡湯10 ml/kg體重（相當于30 g生藥/kg）治療12周后，檢測空腹血糖、HbA1C、血脂、血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量，采用放免法檢測血清TNF-α的表達水平。結果：益腎解毒通絡湯明顯改善DM大鼠的一般狀態，降低血糖，改善肝功能、腎功能，減少血清中TNF-α水平。結論：益腎解毒通絡湯對實驗性DM大鼠腎臟有保護作用，其機制可能與調節糖代謝和脂代謝，改善腎功能，減少尿蛋白排出，降低血清TNF-α水平有關。

糖尿病腎病；益腎解毒通絡湯；腫瘤壞死因子-α

糖尿病腎病（DN）屬糖尿病(DM)微血管病變性疾病，是在臨床常見的糖尿病慢性并發癥。早期表現為尿中排出微量清蛋白，繼之出現臨床蛋白尿，最終進展為慢性腎功能不全。研究表明，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和糖尿病腎病的發生關系密切。益腎解毒通絡湯為南征教授的臨床經驗方,具有益氣養陰、活血祛瘀、降糖解毒之功效，用于治療消渴腎病氣陰兩虛挾瘀毒證。本實驗著重觀察益腎解毒通絡湯對糖尿病大鼠血清TNF-α的影響,為解釋益腎解毒通絡湯的功效提供現代醫學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藥品：益腎解毒通絡湯（方劑組成為生地、黃芪、知母、枸杞子、大黃、黃連、陳皮、雙花、榛花、丹參、坤草、土茯苓）由長春中醫學院制劑室提供，在水浴中濃縮成3 g生藥/ml濃縮液；陽性對照藥－吡格列酮，由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供，批號：國藥準字H20040631；鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司產品。

試劑：尿蛋白酶免法試劑盒為上海德波生物技術有限公司出品；血糖高靈敏試劑盒購自長春生物工程技術有限公司；血清腫瘤壞死因子試劑盒為解放軍總醫院科技開發中心放免研究所出品。

實驗儀器：LD5-2A醫用離心機（北京醫用離心機廠產品），UV755B分光光度計（上海精密儀器有限公司產品），DG-3022A酶聯免疫檢測儀（國營華東電子管廠產品），日立7510型生化自動分析儀（日本）。

實驗動物：清潔級雄性Wistar大鼠由吉林大學基礎醫學院動物室提供。合格證號：SYXK(吉)2003-0001號。

1.2 方法

取雄性Wistar大鼠（體重180～220 g）60只，禁食不禁水12 h，按體重隨機分為兩組，正常對照組10只，DM模型組50只。模型組參照文獻方法，采用鏈脲菌素(STZ)誘導的糖尿病法，單次腹腔注射STZ 50 mg/kg，正常對照組僅腹腔注射等體積上述緩沖液。注射STZ 72 h后，尾靜脈采血測定空腹血糖及尿糖。取血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++以上者，再按體重隨機分為益腎解毒通絡湯組（15只）、陽性對照組（15只）和模型對照組（15只）。于注射STZ后 7 d，中藥實驗組每日上午灌服益腎解毒通絡湯濃縮液10 ml/kg體重（相當于30 g生藥/kg），陽性對照組每日上午灌服吡格列酮5 mg/kg體重，DM模型組和正常對照組每日上午灌服等體積飲用水，連續灌服12周。于服藥終末收集24 h尿量，測定尿蛋白量。次日將大鼠眼眶采血，檢測空腹血糖、HbA1c、血脂、血肌酐及尿素氮。血清TNF-α按照試劑盒說明書要求進行操作，最后在γ放射免疫計數器上測定放射性。最后，用0.9%NaCl溶液灌洗腎臟，剖取腎臟，濾紙吸干，去掉包膜，即刻稱重。

2 結果

2.1 一般情況

正常對照組的大鼠體重明顯增加，精神狀態良好，反應靈敏，動作自如，毛發平伏有光澤，無一只死亡。DM模型組的大鼠明顯消瘦，多飲、多食、多尿明顯；且精神萎靡，反應遲鈍，動作遲緩，毛豎無光澤，弓背蜷體，部分出現爛尾、肢體感染潰爛、白內障（6只）等并發癥，其中有5只因衰竭或出現并發癥而死亡。吡格列酮組也出現類似表現和并發癥，但程度較輕，陽性對照組3只死亡。中藥實驗組大鼠精神狀況、反應、毛色較正常組差，但比DM模型組、陽性對照組好，無合并白內障，實驗過程中有3只死亡。

2.2 益腎解毒通絡湯對糖尿病大鼠血糖、HbA1c及TNF-α的影響

結果表明，注射STZ后12周大鼠的血糖、糖化血紅蛋白及腫瘤壞死因子明顯增高，與正常對照組比較差異明顯。經12周治療后，益腎解毒通絡湯組和吡格列酮組則明顯降低，與模型組相比較，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），且其作用強度前者略高于后者，但差異無統計學意義。見表1。

表1 各組實驗大鼠12周末空腹血糖、HbA1c、血清TNF-α比較（±s）

表1 各組實驗大鼠12周末空腹血糖、HbA1c、血清TNF-α比較（±s）

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DM模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

正常對照組DM模型組益腎解毒通絡湯組吡格列酮組組別 例數（n）10 10 12 12血糖（mmol/L）5.89±0.49 18.81±3.46**13.74±2.75**##14.16±2.56**##HbA1c（%）3.28±0.52 6.43±1.03**4.30±0.81**##4.70±0.84**##TNF-α（mg/ml）1.57±0.16 3.71±0.43*2.43±0.44*#2.57±0.39*#

2.3 益腎解毒通絡湯對糖尿病大鼠TG、TC、血清BUN、Scr的影響

結果表明，注射STZ后12周大鼠的血脂（TG、TC）明顯升高，腎功能（BUN、Scr）顯著升高，與正常對照組比較差異顯著。經12周治療后，益腎解毒通絡湯組和吡格列酮組則明顯降低血脂，其中TG降低幅度前者明顯大于后者，差異有統計學意義（P<0.05）；腎功能（BUN、Scr）障礙均明顯改善，且其改善程度前者略高于后者，但差異無統計學意義。見表2。

表2 各組實驗大鼠12周末TG、TC、血清BUN、Scr比較（±s）

表2 各組實驗大鼠12周末TG、TC、血清BUN、Scr比較（±s）

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DM模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與吡格列酮組比較，▲P<0.05

組別 例數（n）TC（mmol/L）正常對照組DM模型組益腎解毒通絡湯組吡格列酮組10 10 12 12 1.41±0.32 2.64±0.56**1.90±0.59*##1.96±0.59*##TG（mmol/L）0.66±0.16 1.61±0.32**0.94±0.30*##▲1.26±0.39**#BUN（mmol/L）6.75±0.38 20.16±4.59*11.24±4.04*#12.22±3.63*#肌酐（μmol/L）49.16±9.59 91.42±12.48*68.62±11.07*#70.03±9.76*#

2.4 益腎解毒通絡湯對糖尿病大鼠尿蛋白量和腎重量的影響

見表3。注射STZ 12周后大鼠的尿蛋白和腎臟重量明顯增加，與正常對照組比較差異顯著。益腎解毒通絡湯和吡格列酮均明顯降低尿蛋白量和腎臟重量，表明該藥對高糖所致的腎臟微血管損傷有明顯的改善作用。

表3 各組實驗大鼠12周末24 h尿蛋白定量比較（±s）

表3 各組實驗大鼠12周末24 h尿蛋白定量比較（±s）

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DM模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

正常對照組DM模型組益腎解毒通絡湯組吡格列酮組組別 例數（n）10 10 12 12尿總蛋白（mg/24 h）13.88±4.15 51.86±20.79*20.19±9.27#21.26±8.53#左腎重（g）0.88±0.15 1.39±0.87**1.03±0.10**##1.12±0.10**##腎重/體重（mg/g）2.75±0.23 7.42±0.32**4.23±0.16**##4.65±0.16**##△

3 討論

研究證明，高血糖所致的非酶糖化蛋白蓄積是引起糖尿病慢性并發癥的關鍵因素[1]。糖尿病的非酶蛋白糖基化并非只限于血紅蛋白[2-3]，而是有全身傾向的，若蛋白質分子間發生交聯形成穩定的終末代謝產物（AGEs），易于發生病理效應。糖尿病腎病是糖化蛋白AGEs積聚于腎臟，刺激腎小球系膜細胞釋放細胞外基質成分，導致腎小球基底膜增厚、肥大、硬化等病理改變。本實驗證明，益腎解毒通絡湯對血糖及糖化血紅蛋白的形成有明顯的抑制作用，提示該藥具有預防腎小球病變的形成或改善其病變的作用。吡格列酮屬胰島素增敏劑，可減少外周組織和肝臟的胰島素抵抗，增加依賴胰島素的葡萄糖的處理，并減少肝糖的輸出。但本實驗結果它的降血糖及糖化血紅蛋白強度略遜于益腎解毒通絡湯，這可能是由作用靶點過于局限所致。

TNF-α被認為是一種潛在的致纖維化因子，作為炎癥介質在炎癥急性期及硬化過程中起重要作用[4]。Nakamura T等[5]發現DM 4周后，DM小鼠腎小球TNF-α mRNA水平增加2倍，12周后增加3倍，24周后增加4.2倍。研究發現DN中，血清TNF-α和IL－18明顯升高，并且隨著不同臨床階段而升高，在大量蛋白尿階段最高[6-7]。近來研究證明，腫瘤壞死因子（TNF-α）是導致DN早期腎小球血流動力學異常的主要介質[8]，也是高糖時由晚期糖化終末產物（AGEs）所釋放的另一種因子。它可致使誘導型一氧化氮合酶（iNOS）活性增加，一氧化氮（NO）過量產生。過量的NO在DN病理生理過程中起著重要作用。本實驗表明，益腎解毒通絡湯和吡格列酮均能降低血清TNF-α，對腎臟起到一定保護作用。

DN常發生脂質代謝紊亂，促使腎臟的損傷。故控制脂質代謝紊亂也是保護DN腎臟的關鍵措施。本實驗又證明，益腎解毒通絡湯具有一定的調節脂代謝作用，能降低DM大鼠TC、TG水平，其中降低TG幅度明顯大于吡格列酮。說明，益腎解毒通絡湯的改善脂質代謝異常、防止腎臟損傷是另一種作用途徑。

蛋白尿及腎臟肥大是DN早期的主要病理效應，與之相應的病理改變是腎小球基底膜上負電荷丟失、通透性增加、腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞等增生，腎組織體積增大。本實驗結果,益腎解毒通絡湯和吡格列酮明顯降低尿蛋白量，腎重/體重比值低于模型對照組（P<0.01），表明，該藥具有治療糖尿病腎病的直觀依據。

綜上所述，益腎解毒通絡湯具有調節糖代謝和脂代謝、抑制腎臟肥大、降低血清TNF-α水平和尿蛋白量等作用。該藥是是一種多靶點、多途徑的中藥復方制劑，對糖尿病腎病的預防及治療具有十分重要的意義。

[1]Bucala R,Vlassara H.Advaced glycosylation end products in diabetic renal disease:clinical measurement,pathopysiological significance,and prospects for pharmacological inhibition[J].Blood Purif,1995,13(3-4):167-175.

[2]Biemel KM,Friedl DA,Lederer MO,et al.Identification and quantification of major Maillard-crosslinks in human serum albumin and lens protein:evidence for glucosepane as the dominant compound[J].J.Biol.Chem,2002,277(28):24907-24915.

[3]Stewart JM,Kilpatric ES,Cathcart S,et al.Low-density lipoprotein particle size in type 2 diabetic patients and age matched controls[J].Ann.Clin.Biochem,1994,31(Pt 2):153-159.

[4]De Keulenaer G,Vshio FM,Yin Q,et al.Convergence of edox sensitive and mitogen activated protein kinase signaling pathways in tumor necrosis factor alpha mediated monocyte chemoattrac-tant protein 1 induction in vascular smooth muscle cells[J].Arterioscler Thromb Vase Biol,2000,20(2):385-391.

[5]Nakamura T,Fukui M,Ebihara I,et al.mRNA expression of growth factors in glomeruli of diabetic rats[J].Diabetes,1993,42(3):450-6.

[6]Mahmoud RA,el-Ezz SA,Hegazy AS,et al.Increased serum levels of interleukin-1 8 in patients with diabetic nephropathy[J].Ital J Biochem.2004,53(2):73-81.

[7]Moriwaki Y,Yamamoto T,Shibutani Y,et al.Eleated levels of interleukin-18 and tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with type 2 diabetes mellitus:relationship with diabetic nephropathy[J].Metabolism,2003,52(5):606-608.

[8]袁濤.1型糖尿病和B細胞凋亡[J].國外醫學:內分泌分冊,2002,22(1):8.

The effect of Yishen Jiedu Tongluo Recipe on tumor necrosis factor-α in diabetic nephropathy rats

JIN Yinghua1,NAN Zheng2
(1.The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University,Guangdong Province,Guangzhou 510080,China;2.The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chainese Medicine,Jilin Province,Changchun 130021,China)

Objective:To observe the effect of Yishen Jiedu Tongluo Recipe (YSJDTLR)on tumor necrosis factor-α in diabetic nephropathy rats.Methods:The diabetic nephropathy models of rats(n=60)were produced by inducement of Streptozotocin(50 mg/kg)．The blood glucose,glycol-hemoglobin,TC,TG,BUN,SCR,the level of 24 h Urine protein,tumor necrosis factor-α,and Urine protein were measured at 12 weeks after"YSJDTLR"(10 ml/kg)were treated with rats.TNF-α was measured by methods of radioimmunoassay..ResultsThe blood glucose,glycol-hemoglobin,tumor necrosis factorα,TC,TG,BUN,SCR and Urine protein were decreased after YSJDTLR(10 ml/kg)treatment compared with the DM group.Conclusion:The study suggests that YSJDTLR has protective effect on DM rats.The mechanisms might related to the regulation of glucose metabolism and lipid metabolism,and the improvement of kidney function,also decrease of TNF-α.

Diabetic nephropathy;Yishen Jiedu Tongluo Recipe;Tumor necrosis factor-α

R587.2

A

1674-4721（2010）12（a）-017－03

金英花（1979-），碩士研究生學歷；廣東藥學院附屬第一醫院中醫科。

2010-10-15）