副溶血弧菌中具有Mg2+轉運功能的MgtE基因的分子克隆與功能鑒定

李來梅 ，于 峰 ，2 ，靳 磊

（1.湖南省微生物研究所，湖南 長沙 410009；2.湖南師范大學生命科學學院，湖南 長沙 410081）

Mg2+具有獨特的幾何特性和化學特性，研究人員推測其轉運系統也具有獨特性[1]。目前，整個生物界中已發現有五大Mg2+轉運家族:CorA家族，Mg2+/H+交換體，離子通道，P型磷酸酶和MgtE基因家族[2]。主要的Mg2+轉運家族是細菌中的CorA家族，蛋白拓撲分析顯示其具有獨特結構：N端有一個酸性的周質區，C端有2個疏水的跨膜區，有很強的螺旋性。CorA序列上存在保守基序GMN，是其轉運Mg2+所必需的，若GMN基序中有一個氨基酸突變，其轉運能力就會喪失[3]。

MgtE基因家族首先在Bacillus firmus OF4中被Ronald等人在尋找新的CorA基因時發現。目前一般認為其具有五個跨膜區。其跨膜區的分布和CorA具相似性，都主要分布于C端，其N端位于胞質區。MgtE和CorA兩基因家族在轉運離子的類別上也具有部分相似性。MgtE的突變株和CorA一樣可增強對Co2+的抗性。MgtE可功能互補缺失CorA，MgtA，MgtB Mg2+轉運系統的沙門氏桿菌突變株MM281，使其可在低濃度 Mg2+濃度（<10 mM）下生長。同時MgtE 也具有Co2+，Cd2+，Mn2+等二價金屬離子的轉運能力。多序列比對表明其第二和第五個跨膜區較保守。基因組序列搜索顯示MgtE家族在古細菌，原核生物和真核生物中都有分布，但其分布的廣泛性不如CorA家族。目前對MgtE基因家族轉運Mg2+的分子機制還了解甚少。為了更進一步了解MgtE基因家族轉運Mg2+的分子機制，筆者從副溶血弧菌中克隆了其MgtE基因，將之稱為VP-MgtE，并對其進行了功能鑒定和定點突變等實驗。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 E.coli DH5α 在37℃，LB培養基中生長，必要時添加相應抗生素。副溶血弧菌于37℃，LB中培養。S.typhimurium MM281需要高濃度Mg2+才可以生長，它被用于功能互補實驗，于37℃，Mg2+（以MgSO4的形式添加）終濃度為100 mM，氯霉素濃度為34μg/mL的LB或N-minimal培養基中生長。

1.1.2 試 劑 2pMD18-T載體和所有酶類均購自大連寶生物工程有限公司。質粒純化及膠回收試劑盒購自長沙安比奧生物技術公司。pTrc-99A由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 VP-MgtE基因的克隆及載體構建 VP基因組DNA按照Flamm[4]的方法提取。根據VP-MgtE基因序列用Primer Premier5.0設計一對引物，并添加酶切位點SacⅠ和KpnⅠ。正向引物為［TATGAGCTCGAACGAATGGCAG（SacⅠ）］反向引物為［ATAGGTACCACTGGCTTAGATCAGC（KpnⅠ）］。用高保真酶Pyrobest DNA polymerase進行PCR擴增。回收目的片段，連接到pMD18-T載體上，再用SacⅠ和KpnⅠ酶切，定向克隆至表達載體pTrc99A，并酶切鑒定陽性克隆。

1.2.2 生物信息學分析的主要軟件及數據庫 基因序列數據由NCBI中獲得。跨膜區分析軟件為TMHMM，多序列比對軟件為ClustalW，常規的核酸蛋白分析軟件利用DNAMAN進行。

1.2.3 MM281的功能互補和鋁離子毒害實驗 將pTrc99A-VP-MgtE質粒電擊轉化進入MM281。鑒定陽性克隆，分別挑取MM281-VP-MgtE，MM281-pTrc，MM281單菌落在試管中過夜培養。然后再按50∶1（LB∶菌液＝50 mL∶1 m）的比例接種于含有相應抗生素的錐形瓶中擴大培養。同時測值。當達到0.6～0.7之間時，加入1mM/L的IPTG進行誘導，當到達1.0時取出，取菌液100μL加入 900 μL 水中。分別稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五個梯度。取稀釋的菌液2μL點樣于不同Mg2+濃度的互補平板上，Al3+（以AlCl3的形式添加）毒害中點樣于pH 5，Mg2+濃度為100 mM的LB固體培養基上。37℃倒置培養2 d后觀察菌落生長情況并拍照。

1.2.4 液體生長曲線 挑取MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-pTrc的單菌落在含相應抗生素的LB中搖菌，當OD600=0.6～0.8時，1 200 rpm離心收集細胞，用去離子水清洗兩遍，以除去殘留的Mg2+，然后用去離子懸浮。準備7種不同濃度（0μM，50μM，100μM，500μM，1 mM，5 mM，10 mM）和相應抗生素的N-minimal培養基，將上述準備好的培養物（起始=0.001～0.002）加入N-minimal培養基中。37℃搖菌，每2 h測一次并記錄數據。共測24 h。

1.2.5 離子敏感性實驗 按功能互補實驗過程一樣準備好菌液，然后點至不同濃度的金屬離子板上。37℃倒置培養2 d后觀察其生長情況并拍照。

1.2.6 定點突變 定點突變的方法按照分子克隆上介紹的重疊延伸誘變的方法分別設計兩對引物。從野生型VP-MgtE-pTrc99A中用高保真酶Pyrobest DNA polymerase進行三次PCR。再SacⅠ，KpnⅠ雙酶切，定向構建至pTrc-99A上產生特異位點的突變。突變引物設計見表1。再按照1.2.3的方法進行功能互補實驗。

表1 突變引物設計表

2 結果與討論

2.1 VP-MgtE與MgtE基因家族其它成員相比顯示部分序列相似性

VP-MgtE的編碼一個含451個氨基酸的蛋白質。跨膜分析顯示其具有五個跨膜區。其與Bacillus firmus OF4和Providencia stuartii中的MgtE序列分別具有21.15%，14.69%的相似性。多序列比對表明它們在第二和第五個跨膜區具有較高的相似性（見圖1）。

圖1 VP－MgtE與MgtE家族其他基因clustalw比對圖

圖1 為VP-MgtE和MgtE家族其他成員運用ClustalW的比對結果。TM2，TM5方框標示處的A、G、D、G位點表示突變后對其功能影響很大者，TM4，TM5方框標示處的D、L位點表示對其功能影響較少者，TM4方框標示處的P位點表示無影響。圖中標出的五個跨膜區（TM1-TM5）為根據VPMgtE的蛋白拓撲結構預測所得到。比對中其他基因 GenBank登陸號分別為 B.firmus：U18744；P.stuartii：U23806；Human；NM_173854。

2.2 VP-MgtE可功能互補MM281的生長

MM281是一類喪失了 CorA，MgtA，MgtB Mg2+轉運系統的沙門氏桿菌突變株。它只能在高濃度Mg2+（>100 mM）下達到最佳生長速度。結合功能互補的方法，它可作為一個研究Mg2+轉運的很好的系統。表達了VP-MgtE的MM281重組菌株可在低濃度Mg2+情況下生長，甚至在不加Mg2+的LB培養基上生長。而其陰性對照MM281，pTrc99A-MM281則只能在大于10 mM的N-minimal培養基上生長（見圖2）。結果說明，VP-MgtE的表達互補了MM281在Mg2+轉運上的功能缺失，使之重新具有了Mg2+轉運能力。從而使其可在含低濃度（<10mM）Mg2+的培養基中生長。生長曲線結果也再次證明了目的基因的轉運能力。由圖3、圖4可知，表達了目的基因的MM281轉化子可在 100μM的N-minimal培養基中生長。而陰性對照只能在10 mM的培養基中生長。

圖2 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE在不同Mg2+濃度的N-minimal互補平板上的生長結果

圖3 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE 在 10 mM Mg2+的N-minimal培養基中的生長結果

圖4 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE 在 100 μM Mg2+的N-minimal培養基中的生長結果現差別

2.3 VP-MgtE的表達改變了MM281的離子敏感性

已有研究顯示，當細菌中積累一定量的重金屬離子（如 Co2+，Cd2+，Mn2+，Zn2+）時，就會對細菌本身產生毒害作用并使之死亡。由圖5可知，表達了VP-MgtE基因的轉化子增加了對Ni2+，Co2+，Mn2+，Cu2+的敏感性，當 Ni2+，Co2+，Mn2+，Cu2+離子濃度分別達到500μM，500μM，500μM，1 mM 時，表達了目的基因的菌株就會死亡。可以認為VP-MgtE有Co2+，Cd2+，Mn2+，Zn2+，Ni2+，Fe2+，Cu2+離子的轉運能力。

2.4 VP-MgtE的表達提高了MM281對鋁毒害的抗性

研究表明當pH<6時鋁離子就可從結合態釋放出來產生毒害作用。在pH=5時研究了VP-MgtE的鋁抗性，結果表明VP-MgtE的表達可提高MM281對鋁毒害的抗性（見圖6）。為了證實確實是Al3+而不是Cl-在起毒害作用，同時做了KCl的實驗，與對照相比，實驗數據沒有區別。

2.5 定點突變改變了VP-MgtE的Mg2+轉運能力

圖5 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE在含有不同金屬離子濃度的N-minimal固體培養基上的生長結果

圖6 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE在含不同鋁離子濃度的LB平板上的互補結果

運用定點突變的方法對VP-MgtE蛋白中的7個氨基酸進行了突變，由圖7可以發現，VP-J1，VP-J2，VP-J5，VP-J6 的突變使目的蛋白的 Mg2+轉運能力有很大的降底，VP-J4的轉運能力和目的蛋白相比，有輕微的降底，VP-J3，VP-J7出乎實驗預期，在10μM情況下和目的蛋白相比這兩個突變株的轉運能力明顯提高。這些突變都集中在第2和第5跨膜區。在這兩個跨膜區的每個突變對其轉運能力都有影響，這也說明了這兩個跨膜區在Mg2+裝運中的重要性。

圖7 定點突變結果

3 討論

序列分析顯示VP-MgtE的蛋白序列與目前已知的MgtE家族成員顯示了部分相似性，多序列比對表明，它們在第2和第5個跨膜區和其它成員有較高的相似性。在一些特定的保守基序中MgtE家族成員具有完全的相似性，如第5個跨膜區的DP基序。實驗運用定點突變的方法研究了這些保守區域，結果顯示，當這兩個跨膜區中的一些保守氨基酸突變以后，它的鎂離子轉運能力和野生型相比有明顯下降，甚至是完全喪失。同時本課題組還從不同的菌種克隆了3個MgtE家族成員并進行了功能鑒定，它們在這些保守的基序中也是完全一致的。由此可見，這些保守的氨基酸是MgtE家族發揮Mg2+轉運功能所必需的。

此外，實驗結果還表明VP-MgtE轉運Mg2+不受pH值的影響。同時在實驗中還發現VP-MgtE在高濃度的Mg2+下的生長反而不如在低濃度的情況下生長的快，因此猜測VP-MgtE可能為一類高親和性，轉運鎂離子的載體蛋白。

[1]Gibson M M，Bagga，Maguire M E.Magnesium transport in Salmo nella yphimurium:The influence of new mutation conferring Co2+resistance on the CorA Mg2+transporter system[J].Mol.Microbiol，1991，（5）：2753－2762.

[2]Richard CG.Genes for magnesium transport[J].Current Opinion，2003，（6）：263-267.

[3]Li L，Ana F T，Revel S M，et al.A Novel Family of Magnesium Transport Genes in Arabidopsis[J].The Plant Cell，2001，（13）：2761-2775.

[4]Flamm R K，Hinrichs D J，Thomashow M F.Introduction of pAM beta 1 into Listeria monocytogenes by conjugation and homology between native L[J].monocytogenes plasmids，1984，44：157-161.