應用多肽芯片研究非小細胞肺癌患者血清中的EGFR自身抗體

李元 岳文濤 王玥 張麗娜 顧勐 許紹發

肺癌是全球范圍內最常見和最致命的惡性腫瘤之一，對人類的生命和健康構成嚴重威脅。研究[1]顯示臨床上無法發現的早期腫瘤即可以出現血清中自身抗體陽性，因而血清自身抗體有望作為肺癌早期診斷的分子標志。目前常用ELISA方法進行血清自身抗體檢測，但是傳統的ELISA方法使用蛋白作為抗原，只能檢測到血清中有無自生抗體而并不能確定抗體所識別的抗原表位，因而臨床應用意義有限，而目前抗原表為已被廣泛地應用于疾病診斷、預后評價和疫苗的研發[2-4]。多肽芯片是近年發展起來的一種新技術，所謂多肽芯片就是將蛋白質分解成肽段合成到纖維素膜上組成密集的點陣，與傳統的ELISA方法相比，多肽芯片不僅能檢測到血清中的自身抗體，而且能夠確定自身抗體所識別的抗原表位，為進一步研究自身抗體的功能提供線索，因此多肽芯片已被廣泛地應用于抗體研究[5-7]。本研究利用多肽芯片檢測非小細胞肺癌者血清中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的自身抗體，并確定其識別的抗原表位，為進一步研究EGFR自身抗體與肺癌的早期診斷和預后之間的關系提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清 肺癌患者血清共20例，其中腺癌和鱗癌各10例，所有肺癌患者均經術后病理明確診斷，同時取10例健康人血清作為正常對照，所有上述血清均取自北京胸科醫院細胞生物學實驗室標本庫2008年2月-2009年2月收集的標本。

1.1.2 試劑 Fmoc-基團保護的20種天然氨基酸干粉（德國，Intavis公司），1-甲基-2-吡咯烷酮（1-methyl-2-pyrrolidone，NMP，Sigma公司），溴酚藍（Bromphenol blue，BPB，Sigma公司），1-羥基苯并三唑（Hydroxybenzotriazole，HOBt，上海吉爾生化），二異丙基碳二亞胺（Diisopropyl carbodiimide，DIC，Sigma公司），二甲基甲酰胺（Dimethylformamide，DMF，Sigma公司），乙酸酐（Acetic anhydride，國藥集團），哌啶（Piperidine，國藥集團），乙醇（Ethanol，Sigma公司），三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA，Sigma公司），三異丙基硅烷（Triisopropylsilane，Sigma公司），二氯甲烷（Dichlormethane，DCM，Sigma公司）。

1.1.3 儀器 多肽芯片合成儀ASP SL（德國，Intavis公司）

1.2 方法

1.2.1 EGFR蛋白胞外段肽庫合成 此肽庫共包括204個肽段，每個肽段的長度為12個氨基酸（aa），相鄰兩個肽段之間重疊9個氨基酸，使用Fmoc-保護的20種氨基酸，按照Intavis公司ASP SL多肽芯片合成儀說明書進行多肽合成，將該204個肽段按6行×34列的順序合成到纖維素膜上，即構成了多肽芯片。

1.2.2 多肽芯片質量控制 多肽芯片合成過程中，每完成一個循環均用乙酸酐進行Caping，封閉未反應的NH2-基團；同時用哌啶Deprotecting脫去Fmoc-保護基團，使被保護的NH2-基團暴露，以便進行下一個循環；哌啶Deprotecting之后，用染色劑溴酚藍（BPB）進行染色，以確定未反應的NH2-基團已被封閉同時被保護的NH2-基團已經游離，以便進行下一個循環。如此完成12個循環。待芯片合成結束后進行紫外照相，進一步觀察芯片合成質量。

1.2.3 混合血清中EGFR自身抗體的檢測 使用EGFR多肽芯片分別檢測8例肺癌患者混合血清和10例健康對照者混合血清，以確定EGFR自身抗體在肺癌患者血清中是否存在。步驟如下：首先將膜水化（100% ETOH×10 min→75%ETOH×10 min→50% ETOH×10 min→PBS×30 min），用含有0.2% Tween-20和5%脫脂牛奶的PBST溶液室溫封閉3 h，按照1:1 000的比例稀釋混合血清與多肽芯片共同孵育，4oC孵育過夜，PBST洗膜20 min×4次，抗人HRP-標記山羊抗人IgG（1:10 000稀釋）室溫孵育2 h，最后用PBST洗膜15 min×3次，PBS洗膜15 min×3次，ECL（普利萊公司）化學發光檢測。

1.2.4 檢測EGFR自身抗體識別的抗原表位 使用EGFR多肽芯片分別檢測20例肺癌患者血清，以確定EGFR自身抗體在多肽芯片上所識別的特異性位點即抗原表位。步驟同混合血清檢測。

1.3 數據分析 用Excel進行數據整理。高頻位點的確定，以頻率（F）＞2×中位數（Md）為判斷依據。

2 結果

2.1 質量控制 在合成過程中，每一個循環去保護后經溴酚藍染色發現：芯片背景無著色；芯片上的點著色均勻、無重疊，質量良好。芯片合成后紫外照相，結果如圖1所示，共204各點，以6行×34列的方式排列，單點圓形無缺失，點和點之間無重疊，符合實驗要求。

2.2 混合血清檢測結果 芯片檢測結果顯示在肺癌患者混合血清中存在EGFR自身抗體，而在健康對照者混合血清中不存在EGFR自生抗體。如圖2A所示黑色位點即為肺癌患者混合血清中EGFR自生抗體所識別的抗原表位即陽性位點；而在健康對照者混合血清中則無陽性位點存在如圖2B所示。

2.3 EGFR自身抗體識別的抗原表位 使用EGFR多肽芯片檢測20例肺癌患者血清，結果發現有6例陽性，陽性率30%，其中4例腺癌，2例鱗癌。將該6例陽性患者血清中EGFR自身抗體所識別的抗原表位作成頻率分布圖，如圖3所示，結果發現有9個高頻位點存在，該9個高頻位點的頻率（F）＞2×中位數（Md=16.66%）。其中A9、D4、D10、D13、E29的頻率為33.33%；D14、E28的頻率為50%；E9、E27的頻率為66.67%。9個高頻位點在EGFR蛋白胞外段的位置分布如圖4所示，高頻位點主要集中在EGFR蛋白胞外段的第III和第IV結構域，此外第I結構域也有1個高頻位點出現。位于第III結構域的高頻位點為D4、D10、D13、D14、E9；位于第IV結構域的高頻位點為E27、E28、E29；位于第I結構域的高頻位點為A9。高頻位點所對應的多肽序列即相應的抗原表位見表1。

3 討論

非小細胞肺癌患者約占肺癌患者總數的80%，絕大部分患者在就診時已處于晚期，因而發展新的非小細胞肺癌早期診斷方法便成為解決這一問題的關鍵。研究[8]顯示臨床上無法發現的早期腫瘤即可以出現血清中自身抗體陽性，因而血清自身抗體有望作為肺癌早期診斷的分子標志。

圖 1 EGFR多肽芯片合成后紫外照相結果。Fig 1 UV photogram after peptide-array of EGFR synthesized.The library consists of 12 amino acids long peptides with 9 amino acids overlapping with the adjacent peptides immmobilised on a cellulose membrane. Letters on left-side hand of the array indicate rows. Numbers on the upper side of the array indicate columns.

圖 2 混合血清檢測結果。A：8例肺癌混合血清檢測結果，圖中黑色位點即為陽性位點；B：10例健康人混合血清檢測結果，無陽性位點。Fig 2 The result of mixed serums which is tested by peptide-array. A: The result of mixed serums of 8 NSCLC patients which is tested by peptidearray; B: The result of mixed serums of 10 nomral subjects which is tested by peptide array.

圖 3 陽性位點頻率分布圖。將多肽芯片上的204個點作為橫坐標，將這些位點在6例陽性患者中出現的頻率作為縱坐標。若一位點若在6例陽性患者中均出現則頻率為100%，一位點若在6例陽性患者中均不出現則頻率為0.00%。Fig 3 Frequency distribution of positive spots. Abscissa is the 204 sites in peptide array, Ordinate is the frequencies of the 204 sites in the 6 positive patients. One site is positive in all 6 patients, its frequency is 100%; One site is negative in all 6 patients, its frequency is 0.00%.

圖 4 高頻位點在EGFR胞外區位置分布圖。EGFR胞外區共包括621個氨基酸，分成I、II、III、IV 4個結構域。 代表的頻率為33.33%， 代表的頻率為50%， 代表的頻率為66.67%。Fig 4 Distribution of high frequency spots in the extracellular domain of EGFR. The extracellular domain of EGFR consists of 621 amino acids and includes Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ structural domains. The frequency of is 33.33%,The frequency of is 50%, The frequency of is 66.67%.

表 1 EGFR自身抗體識別的高頻位點及其對應的多肽序列Fig 1 The high frequency spots and the sequence of these spots

EGFR在腫瘤的發生、發展和侵襲中發揮了重要作用，研究[9]表明多種人類腫瘤的發生與人體EGFR的過度表達有關，Nakamura等[10]進行了大量的回顧性分析發現在39%的肺腺癌和58%的肺鱗癌中存在EGFR的過度表達，過度表達的EGFR為腫瘤的生長提供了生存信號使腫瘤避免凋亡。1996年，Glushkov等[11]發現在肺癌病人血清中存在EGFR自身抗體；隨后Bei等[12]的研究顯示不僅在肺癌病人血清中存在EGFR自身抗體，在乳腺癌、胃癌、前列腺癌病人血清中也存在著EGFR自身抗體，這些研究表明EGFR自身抗體存在于多種腫瘤中。然而上述研究只是簡單地檢測了EGFR自身抗體的有無，并未對EGFR自身抗體所識別的抗原表位進行研究，因而其對基礎科研和臨床應用的意義有限。

本研究使用EGFR多肽芯片對非小細胞肺癌患者血清中的EGFR自身抗體進行研究，不僅能檢測 EGFR自身抗體是否存在，同時還能確定EGFR自身抗體所識別的抗原表位，為進一步研究EGFR自身抗體的功能提供了新的依據。混合血清檢測結果顯示在肺癌患者血清中存在EGFR自身抗體，而在健康對照者血清中不存在EGFR自身抗體，這與Bei等[8]使用Western方法得到的結果相同，這說明多肽芯片這一方法可以用于非小細胞肺癌患者血清中EGFR自身抗體的檢測，同時也提示EGFR自身抗體有望作為非小細胞肺癌的標志物用于肺癌的早期診斷。

EGFR多肽芯片無論是在檢測肺癌患者混合血清還是檢測肺癌患者單個血清時，均發現了EGFR自身抗體所識別的抗原表位，目前關于EGFR自身抗體研究的報道很少，而關于EGFR自身抗體所識別抗原表位的研究這應該還是第一次，因而EGFR自身抗體所識別的抗原表位的發現將對后續的研究提供新的線索。

單個血清檢測結果發現在20例非小細胞肺癌患者中有6例陽性，EGFR自身抗體在這6例陽性患者中所識別的抗原表位不完全相同，但是也有一些抗原表位被這些陽性患者同時識別，因而便產生了一些高頻位點。這9個高頻位點在6例陽性肺癌患者中出現的頻率為33.33%-66.67%，高頻位點的存在提示在EGFR蛋白胞外區存在著一些重要的功能位點，阻斷這些功能位點就有可能影響EGFR信號轉導通路的功能。通過做高頻位點結構分布圖發現這些高頻位點主要集中在EGFR蛋白胞外段的第III和第IV結構域，此外第I結構域也存在1個高頻位點。晶體結構研究[13,14]發現EGFR與其配體的結合部位主要由EGFR胞外區的第I和III結構域組成；第IV結構域主要調節第II結構域的功能，而第II結構域為EGFR胞外段的二聚化臂。高頻位點集中在這些結構域，可能是通過影響這些區域的功能，而進一步影響EGFR信號轉導通路的功能。高頻位點和高頻位點集中分布這兩個現象的發現，為我們進一步研究EGFR和EGFR自身抗體的功能提供了新的線索。

綜上所述，本研究利用多肽芯片檢測到了肺癌患者血清中存在EGFR自身抗體，同時發現了EGFR自身抗體識別的高頻位點和高頻位點的集中分布，為進一步研究EGFR自身抗體的作用機制提供了理論基礎，同時也為疫苗的研發指明了方向，隨著研究的不斷深入EGFR自身抗體將對肺癌的診斷、治療和預后評價提供更大的幫助。