軟骨源性形態發生蛋白-1的研究進展

趙亮 湯譯博 蘇佳燦

軟骨源性形態發生蛋白-1的研究進展

趙亮 湯譯博 蘇佳燦

1994年，Storm等[1]發現了生長分化因子-5（Growth/Differentiation Factor-5，GDF-5）；同年，Chang等[2]克隆出一種名為軟骨源性形態發生蛋白-1（Cartilage-derived morphogenetic protein-l，CDMP-1）的多肽，并證實兩者是同一種蛋白因子。CDMP-1是骨形態發生蛋白（BMP）家族中的新亞型，作用于骨骼系統，具有多種調節功能，特別是能促進軟骨形成和發育，可以用于軟骨、骨、關節、肌腱、韌帶、椎間盤等的治療。本文就CDMP-1的研究進展進行綜述。

1 CDMP-1的分子結構

CDMP-1的編碼基因最早由Hotten等[3]從人胚胎cDNA庫中克隆獲得，定位于20q11.2染色體，全長488 kb。與BMP家族其他因子一樣，CDMP-1也是由分子間二硫鍵連接的同型二聚體（圖1），共含有501個氨基酸，由位于N端的信號肽、中間的前體肽以及C端的成熟肽構成[4]。其中，前區由376個氨基酸組成，肽鏈蛋白水解位置和120個氨基酸組成的C-末端區中含有7個TGF-β家族成員所特有的保守半胱氨酸殘基團[5]。前體蛋白裂解為成熟肽后，N端肽鏈延長，蛋白異型化，從而改變了CDMP-1的分布，使得骨關節處CDMP-1的含量增加，進而發揮其誘導軟骨生成的特殊生物學作用[6]。

圖1 CDMP-1的分子結構

2 CDMP-1的生物學作用

2.1 促進軟骨及骨的發育

CDMP-1主要表達于四肢骨肢端、關節區、胚胎發育期骨骼前體及其周圍、軟骨母細胞聚集區及形成軟骨前體的組織周圍，是四肢骨發育（尤其是早期軟骨化階段）的重要調節因子。在軟骨發育早期，CDMP-1以劑量依賴的方式促進軟骨祖細胞在一定部位聚集、黏附，在軟骨發育晚期則刺激軟骨細胞的肥大、增生和成熟[7]。Takahara等[8]在研究CDMP-1缺失的鼠模型時發現，其趾骨在發育過程中出現間充質細胞（前軟骨細胞）的凋亡以及干細胞聚集、分化等的延遲，認為CDMP-1促進了趾骨發育。Francis-West等[9]利用逆轉錄病毒載體，使CDMP-1過度表達，增加了雞肢芽的寬度和長度。最初認為直接原因是軟骨細胞數量的增多；進一步觀察發現，用外源CDMP-1刺激軟骨發育初期的間充質細胞，可以顯著促進細胞聚集和軟骨分化，但并不增加細胞的數量；而用脈沖標記實驗監測轉染CDMP-1基因的軟骨祖細胞軟骨發育后期的作用，結果表明CDMP-1明顯促進了軟骨細胞的增殖。作為一種生物信號，CDMP-1受到BMP家族其他成員的調節，控制雞胚肢芽中趾骺區軟骨的發育[10]；并與其他多種信號分子一起，促進胎兒出生后關節軟骨細胞和肢體軟骨源性細胞合成蛋白聚糖[11]。此外，CDMP-1還存在于成年牛和人的關節軟骨中，參與正常軟骨表型的維持以及病變組織的再生反應[12]。

2.2 誘導分化為軟骨及骨

CDMP-1是一種多肽生長因子，具有特異的軟骨誘導能力，可在異位誘導軟骨形成。大量實驗證實，CDMP-1能在體外誘導骨間充質細胞、骨膜源性細胞等，形成軟骨樣結構。Spiro等[13]將含有0.01mg/m L和0.1mg/m L兩種濃度rhCDMP-1的Ⅰ型骨膠原/羥基磷灰石載體植入SD大鼠的皮下以及脛骨后肌內，2周后發現皮下和肌肉內堿性磷酸酶的活性隨rhCDMP-1濃度的增高而增加，提示在這些部位異位誘導了軟骨和骨的生成。該實驗還證實，在膠原或HA存在的條件下，CDMP-1可誘導體外培養的胎鼠顱頂細胞形成軟骨結節。Kakudo等[14]將含有不同濃度CDMP-1（0μg、100μg、300μg、500μg）的Ⅰ型膠原植入24只Wistar鼠的腓腸肌內，3周后進行X射線及組織學分析，發現0μg組和100μg濃度組沒有生成軟骨組織，而300μg濃度組有大量軟骨組織積聚以及部分骨形成，而500μg組形成了骨小梁和骨髓，不含任何軟骨成分。呂學敏等[15]用重組人CDMP-1干預體外培養的鼠肢芽細胞微團，發現100mg/mL的CDMP-1促軟骨化作用最強，另外特定濃度的CDMP-1可促進肢芽細胞的增殖，提示在肢體形成階段，CDMP-1在體內可能通過調控細胞增殖和軟骨分化來實現對骨骼系統發育的調節。Gruber等[16]在骨膜源性細胞的誘導分化研究中發現，體外培養軟骨組織時添加最優濃度的CDMP-1、CDMP-2，并沒有出現多糖合成的協同增加作用；CDMP-l濃度為100 ng/mL時，可達到最大的生物學效能，繼續提高CDMP-1濃度并不會增強促基質合成的作用。上述實驗均表明，CDMP-1的促軟骨分化作用有劑量依賴性，并存在效應閾值。

TGF-β是軟骨形成過程中的必需調節因子，在胚胎發育期有較高的表達，是體外誘導骨髓基質細胞（BMSCs）軟骨化研究的重點對象。但有研究顯示，在無血清培養基中單獨使用小劑量TGF-β，并不能促進BMSCs向軟骨細胞轉化；而在聯合使用BMP-6、胰島素樣生長因子(IGF)-l等其他因子后，Ⅱ型膠原表達和糖胺聚糖（GAG）含量增加，表現出明顯的軟骨化效應。研究表明，高劑量的CDMP-1與TGF-β一樣，可促進BMSCs的軟骨化，兩者聯合使用能協同促進BMSCs的增殖和軟骨化[17]。尹爍等[18]證實，用CDMP-1誘導人真皮成纖維細胞，所得細胞能向軟骨細胞表型分化，并能分泌軟骨細胞特異性基質，通過CD49介導的細胞與細胞、細胞與基質之間的相互作用，有助于維持人真皮成纖維細胞軟骨化后的表型。

2.3 對肌腱/韌帶、椎間盤的作用

2.3.1 修復肌腱、韌帶損傷

研究表明，CDMP-1還存在于肌腱細胞和韌帶細胞中，對兩種組織的發育起到相同的促進作用。Chhabra等[19]發現，CDMP-1缺失的小鼠肌腱損傷后，細胞GAG和膠原濃度需要更長時間才能達到峰值，膠原原纖維改變的時間延遲，血管形成時間延遲近l周。這提示CDMP-l在細胞聚集、遷移、分化、增殖和血管形成中起重要作用，CDMP-l的缺失可導致肌腱愈合延遲。Forslund等[20]發現，CDMP-1、2、3在改善肌腱、韌帶修復以及骨合成方面表現相似。Bolt等[21]用腺病毒載體將CDMP-1轉染至SD大鼠，治療Achilles肌腱撕裂的部位，2周后組織學和生物化學分析顯示，轉導了CDMP-1的肌腱裂隙最小，肌腱修復后被拉長70%。Dines等[22]以rhGDF-5治療肌腱損傷，發現受損肌腱明顯肥大，愈合率顯著升高。

2.3.2 修復椎間盤退變

椎間盤細胞是一種軟骨樣或纖維軟骨樣細胞，在大小、分布和ECM方面與關節軟骨細胞類似。由于CDMP-1能夠促進懸浮培養的軟骨細胞增殖，提示可通過CDMP-1來提高活性細胞的數量，進而修復退行性椎間盤病變（Degeneration disc disease，DDD）。Wang等[23]用腺病毒載體將CDMP-1及TGF-β分別轉染到兔和人椎間盤細胞中，發現過量表達的CDMP-1及TGF-β可以促進椎間盤細胞的增殖以及髓核、纖維環細胞的生長。Li等[24]發現，CDMP-1基因敲除小鼠的椎間盤內纖維結構排列紊亂，纖維軟骨成分替代了正常的纖維環，Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖基因表達下降。用不同濃度的重組人CDMP-1體外培養該小鼠椎間盤細胞20周后，蛋白聚糖合成以及Ⅰ、Ⅱ型膠原基因的表達隨CDMP-1劑量增大而增加。Walsh等[25]研究鼠椎間盤壓力退變模型發現，將CDMP-1注入退變的活體鼠尾椎間盤內，內側纖維環的軟骨細胞可遷入髓核中，并活躍表達蛋白聚糖和Ⅱ型膠原。Chujo等[26]研究兔第2腰椎間盤穿刺退變模型發現，注射重組人CDMP-1能促進椎間隙恢復，增加MRI評分。Maitre等[27]的研究同樣證實了CDMP-1可促進人退行椎間盤中蛋白聚糖的合成以及細胞間質的修復。由此可見，椎間盤內單一注射重組人CDMP-1，能夠修復退變椎間盤。

2.4 其他作用

CDMP-1對神經系統具有營養和保護作用。早期研究表明，CDMP-1可以顯著減輕羥基多巴胺對小鼠黑質體多巴胺能神經元的損害。Aideen等[28]發現，CDMP-1可以保護中腦多巴胺能神經元，并促進其神經傳導功能，提示CDMP-1可用于帕金森氏癥等神經退化性疾病的治療。Zeng等[29]則發現，CDMP-1不但可以誘導小鼠骨分化，還可以通過增加血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達以促進小鼠間質細胞生成血管。

CDMP-1還能調節牙胚發育、刺激牙齦韌帶細胞增殖和基質代謝。Sumita等[30]發現，在牙的生成過程中，CDMP-1可以聯合BMP-2等生長因子，促進牙乳頭及濾泡的分化。最新研究表明，心肌梗死的WT小鼠模型中，心臟的CDMP-1含量明顯升高，梗死灶周圍心肌細胞和成肌纖維細胞的表達也增加，提示CDMP-1在心肌梗死后的心臟修復中發揮一定作用[31]。

3 CDMP-1的作用機制

人們對CDMP-1作用的受體機制研究較為深入（圖2）[32]。目前已知Sox9轉錄因子是軟骨發生的基礎，而Runx2轉錄因子是骨發生的基礎。CDMP-1可以誘導間充質干細胞表面BMP IB型受體（即ALK-6受體）的低聚以及ⅡB型受體的活化，從而導致Smad蛋白磷酸化。磷酸化的Smad蛋白進入細胞核，直接結合DNA或間接結合其他蛋白，從而調控Sox9和Runx2的表達，誘導前成骨細胞以及分泌性成骨細胞的分化，同時還可以促進堿性磷酸酶（ALP）等成骨相關蛋白的表達[33]。最新研究表明，CDMP-1和BMP2一樣，可以通過活化BMPR2來穩定XIAP，以抑制細胞凋亡、促進生長[34]。Liu等[35]發現，在人風濕性成纖維樣滑膜細胞中，CDMP-1可以被IL-1β抑制，促進TGF-β3介導的軟骨分化。

圖2 CDMP-1作用的受體機制

關于CDMP-1的信號通路，目前研究尚不充分。已知CDMP-1可以通過p38 MAPK通路來傳導信號，上調ALP、骨涎蛋白以及骨橋蛋白等的表達，而這些蛋白均與前成骨細胞以及分泌性成骨細胞的表型有關[36]。已有研究表明，活化的CDMP-1可以通過p38 MAPK通路促進軟骨形成，而對骨形成的促進作用還需進一步研究。此外，CDMP-1的生物作用除了與其特異性受體結合關系密切外，還受到細胞外基質的影響，細胞外基質和CDMP-1因子的恰當復合是獲得良好的組織修復效果的關鍵。

4 問題與展望

CDMP-1具有多方面的生物學作用，在臨床治療上具有廣闊的應用前景。然而，CDMP-1的生物學作用機制，尤其是信號機制，仍然不完全清楚。CDMP-1在軟骨發育過程、骨折愈合和肌腱修復等方面的作用機制和臨床應用，CDMP-1與愈合環境之間的相互作用，以及生長因子對修復細胞分化調控機制等問題，均有待進一步研究和解決。目前，骨髓間充質干細胞（BMSCs）是組織工程研究領域中的重要種子細胞，關于其誘導分化的機制，一直是組織工程學領域的研究熱點。然而有關CDMP-1對BMSCs刺激誘導作用的報道很少，今后應進一步探討其對BMSCs增殖分化的調節作用以及作用機制。相信隨著以上問題的逐步解決及組織工程技術的不斷改進，CDMP-1會用于更多疾病的治療和預防。

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1673－0364（2010）03－0171－04

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2010年1月9日；

2010年2月26日)

200433上海市第二軍醫大學附屬長海醫院骨科。

蘇佳燦。