小鼠孤雌胚胎干細胞系的建立

王彥 錢德儉 韋多 徐凱 宦晴 呂鴻 高選 陳子江

小鼠孤雌胚胎干細胞系的建立

王彥 錢德儉 韋多 徐凱 宦晴 呂鴻 高選 陳子江

目的利用化學激活的技術，建立小鼠孤雌胚胎干細胞系。方法用鈣離子載體A23187和6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）處理小鼠卵母細胞，待囊胚形成后，分離內(nèi)細胞團，細胞傳代、擴增。待傳至37代時，核型檢測查染色體，用微衛(wèi)星技術進行純合性鑒定，用免疫熒光技術檢測胚胎干細胞表面標記Oct-4、SSEA-1及SSEA-4的表達情況，并用畸胎瘤試驗檢測其多向分化能力。結(jié)果該細胞株為孤雌來源,表現(xiàn)為正常二倍體核型，表達ALK，表面標志物Oct-4、SSEA-1陽性，SSEA-4陰性。體內(nèi)注射后，在局部形成含三個胚層組織的畸胎瘤。結(jié)論通過鈣離子載體A23187和6-DMAP化學激活小鼠卵母細胞，可以得到具有胚胎干細胞特性的細胞株。

孤雌激活胚胎干細胞鈣離子載體A23187 6-二甲基氨基嘌呤

胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)，源于發(fā)育5～7 d的囊胚的內(nèi)細胞團（Inner cellmass，ICM），具有無限增殖和多向分化的特征。按其來源分為正常胚胎來源（絕大多數(shù)）、核移植來源和孤雌來源。

孤雌生殖是指卵子在沒有雄性配子作用的情況下，以外在因素予以激活。孤雌激活的卵子，在低等動物如兩棲類可以產(chǎn)生正常后代個體，在高等動物則僅發(fā)育到囊胚階段，不能繼續(xù)發(fā)育成后代個體。最近有文獻報道，與受精卵來源的ESCs一樣，孤雌來源的ESCs同樣具有無限增殖和多向分化潛能，可在體外誘導分化成各種細胞。因此，若能建立孤雌生殖胚胎干細胞系（Parthenogenetic embryonic stem cells，PGES），可以避免受精卵來源ESCs引發(fā)的宗教、道德和倫理等方面的爭議，有助于進一步推動ESCs的研究和應用。

本實驗擬探索一種高效的PGES細胞建系的方法，并進行了相關的細胞生物學鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

6周齡昆明系雌性小鼠（體重22 g）購自山東大學醫(yī)學院動物實驗中心，清潔級，適應養(yǎng)殖7 d，普通飼養(yǎng)。重度聯(lián)合免疫缺陷（Severe combined im-mune deficiency，SCID）小鼠購自中科院上海生化細胞所。

孕馬血清促性腺激素（Pregnantmare’s serum gonadotropin，PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin，hHCG）、鈣離子載體A23187和6－二甲基氨基嘌呤（6－Dimethylaminopurine，6-DMAP）購自Sigma公司；人類輸卵管液（H uman tubalfluidmedium，HTF）、胚胎培養(yǎng)液G1購自Vitrolife公司；Knockout-DMEM、血清替代物、谷氨酰胺、非必須氨基酸和β-巰基乙醇購自Gibco公司；bFGF購自Chemicon公司；解剖顯微鏡購自Motic公司；Oct-4抗體（兔抗小鼠多抗）、SSEA-1（兔抗小鼠多抗）和SSEA-4抗體（兔抗小鼠多抗）購自中科院上海生化細胞所。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞的收集

選擇6周齡雌性小鼠10只，每只腹腔內(nèi)先注射PMSG 10 U，48 h后再注射hHCG 10U，過13～17 h斷頸處死；摘除輸卵管，注射針挑破輸卵管壺腹部，收集卵丘-卵母細胞復合體，置于胚胎培養(yǎng)液G1中備用。

1.2.2 卵母細胞的孤雌激活

用A23187和6-DMAP進行化學激活卵母細胞：以80μg/mL透明質(zhì)酸酶消化30 s，用HTF洗3遍，再置于含5μmol／L A23187的HTF中，37℃避光放置5min，以HTF洗滌3次后，置于含10μg/mL 6-DMAP的HTF中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后進行激活處理，再以G1進行胚胎培養(yǎng)，胚胎分裂為8細胞后換液，以G2繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段。

1.2.3 PGES細胞的分離和培養(yǎng)

取出囊胚，以機械法分離出內(nèi)細胞團細胞，在鋪有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿中傳代、擴增。培養(yǎng)液為高糖DMEM，內(nèi)含20%knock-out血清替代物、1%非必需氨基酸、1 mM L-谷氨酰胺、0.1 mMβ-巰基乙醇、4 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d后以0.05%胰酶消化，常規(guī)傳代。

1.2.4 PGES細胞的鑒定

1.2.4.1 純合性鑒定

采用微衛(wèi)星技術進行檢測，具體方法參照文獻[1]。

1.2.4.2 特異性細胞表面標記鑒定

取PGES細胞爬片，設置實驗組、空白對照組和陰性對照組（小鼠成纖維細胞）。實驗組與陰性對照組細胞爬片滴加一抗（兔抗小鼠Oct-4，SSEA-1抗體1∶50），空白組滴加PBS，置濕盒內(nèi)于4℃冰箱內(nèi)過夜，PBS漂洗5min（3次），滴加二抗（FITC、IgG），37℃，30min，鏡下觀察并拍照。

1.2.4.3 核型檢測

0.5μg/mL秋水仙素作用6 h，1 mg/mLⅣ型膠原酶消化10min，解剖鏡下收集ES細胞。低滲、固定、制片按常規(guī)方法進行。

1.2.4.4 體內(nèi)分化能力鑒定

在SCID小鼠腋下每注射點接種1.5×105cells/mL的PGES細胞，培養(yǎng)6～8周，取生成的腫塊切片、常規(guī)HE染色，觀察PGES細胞在體內(nèi)的生長、分化情況。

2 結(jié)果

2.1 卵母細胞的收集

對于6周齡昆明系小鼠，PMSG和HCG可有效地超促排卵，5只小鼠共獲得卵母細胞156個（圖1）。

圖1 小鼠卵母細胞（經(jīng)透明質(zhì)酸處理后，已去除周邊顆粒細胞）

2.2 卵母細胞的激活

經(jīng)A23187聯(lián)合6－2DMAP作用后，共有138個卵母細胞被激活（激活率88.46%），其中109個發(fā)生卵裂（卵裂率78.98%），最終形成囊胚56個（囊胚形成率40.58%）（圖2）。

圖2 孤雌激活后不同發(fā)育時期的胚胎（100×）

2.3 PGES細胞的分離和培養(yǎng)

體外培養(yǎng)胚胎至囊胚形成，以機械法分離內(nèi)細胞團細胞（圖3A），在鋪有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿中傳代、擴增。未分化的PGES細胞呈鳥巢狀生長，形成的克隆較扁平，結(jié)構(gòu)均勻，細胞界限不清（圖3B）。

圖3 PGES細胞的培養(yǎng)

2.4 PGES細胞的鑒定

微衛(wèi)星技術檢測結(jié)果顯示，該PGES細胞株為孤雌來源（圖4）。ES細胞特異性細胞表面標志物Oct-4、SSEA-1陽性，SSEA-4陰性（圖5－7）。核型檢測示40，XX（圖8）。將PGES細胞接種于SCID小鼠皮下，8周可見腫塊生成，切片，HE染色，可見三個胚層的組織（圖9）。

圖4 2%瓊脂糖凝膠電泳

圖5 Oct-4陽性（左：熒光顯微鏡；右：相差顯微鏡。40×）

圖6 SSEA-1陽性（左：熒光顯微鏡；右：相差顯微鏡。40×）

圖7 SSEA－4陰性（左：熒光顯微鏡；右：相差顯微鏡。40×）

圖8 核型染色（40，XX）

神經(jīng)組織（外胚層）肌肉組織（中胚層）

圖9 畸胎瘤切片HE染色（40×）

3 討論

所謂孤雌生殖是在無需精子的條件下，自發(fā)或經(jīng)物理、化學刺激，使卵母細胞有絲分裂激活而形成胚胎，并可繼續(xù)發(fā)育成熟而產(chǎn)生后代[2]。許多動物都有孤雌生殖現(xiàn)象，如昆蟲類的蟑螂、蒼蠅、螞蟻、蜜蜂，脊椎動物類的蜥蜴、蛇、魚、鳥及兩棲動物等[3]。而畸胎瘤則是孤雌生殖在人體的病理性體現(xiàn)。

孤雌生殖技術也是建立胚胎干細胞系的一項重要技術[5]，孤雌激活的卵母細胞能夠在某種程度上替代受精卵，以研究卵母細胞的激活進程及原核胚胎的形成[4]，可用于基因治療、器官移植、組織修復、疾病治療等諸多領域。多年來，人們一直在探索孤雌激活的方法，以期卵母細胞達到最大比例的激活并使激活后的細胞能最大程度地發(fā)育，直至胚胎形成[5－6]。激活方法必須簡單有效，發(fā)育成胚泡的比例高，且胚泡的形態(tài)和質(zhì)量好[5]。孤雌激活不充分或培育條件不恰當，都會影響孤雌胚胎的發(fā)育潛力。目前，激活方法主要有兩類:物理方法和化學方法。前者包括機械、溫度以及電刺激，后者包括酶刺激、高滲或低滲環(huán)境、離子處理和蛋白合成抑制劑處理等。

卵母細胞成熟后,一直靜止在第二次減數(shù)分裂的中期。此時，卵母細胞的胞質(zhì)中含有持續(xù)高水平的中期促進因子（MPF）和細胞靜止因子（CSF）。當卵母細胞在正常的受精過程中受到精子的激活時，其胞質(zhì)的Ca2+濃度在一定時限內(nèi)呈脈沖式升高，進而破壞貯存和新合成的CSF，導致MPF失活、減數(shù)分裂恢復、排出第二極體，促進原核形成、卵裂和早期胚胎發(fā)育。因此，卵母細胞激活過程中，細胞內(nèi)Ca2+節(jié)律性脈沖升高起著關鍵性的介導作用。A23187可直接觸發(fā)Ca2+內(nèi)流，達到激活目的[7]。6-DMAP是蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑,能阻止p34蛋白上的第161位酪氨酸磷酸化，導致MPF失活，促進卵母細胞減數(shù)分裂的恢復；還能抑制卵母細胞第二極體的排出，誘發(fā)卵母細胞形成一個二倍體的單原核，實現(xiàn)孤雌發(fā)育的目的[8]。本研究用A23187和6-DMAP激活卵母細胞，得到了88.46%的激活率和40.58%的囊胚形成率。

孤雌胚胎干細胞系建立后，最主要的是確定其是否真正來源于未受精的卵母細胞。在不同個體之間及同一個體的正常組織與某些異常組織之間，微衛(wèi)星位點的重復單位數(shù)目不同，具有豐富的多態(tài)性，是目前在在小鼠遺傳監(jiān)測方面常用的一種方法。經(jīng)微衛(wèi)星技術檢測，我們建立的細胞株為孤雌來源。結(jié)合細胞表面標志物、核型分析、和致畸胎瘤實驗的結(jié)果，可以判斷該細胞株具有胚胎干細胞特性。

PGES具有和正常受精囊胚來源的ESCs一樣的生物學特征，可以在體外無限增殖，保持未分化狀態(tài)。但是哺乳動物孤雌胚胎來源的干細胞由于缺乏父源性印記基因，分化能力較正常受精卵來源的ESCs差。目前，對于孤雌胚胎干細胞向3個胚層分化的能力看法不一。Newman-Smith等[9]發(fā)現(xiàn)，來自鼠孤雌胚胎的ICM在增殖和分化方面存在缺陷。由于缺乏胰島素樣生長因子-1受體和胰島素樣生長因子-2的基因表達產(chǎn)物，源自孤雌胚胎的ICM不能保持未分化的干細胞狀態(tài)，且?guī)缀醴只癁楠氂械捏w壁內(nèi)胚層細胞。有研究證實，孤雌胚胎干細胞的分化潛能主要是在向內(nèi)胚層和中胚層分化時受到限制。以往我們也發(fā)現(xiàn)，在體外的誘導分化實驗中，可以在短期內(nèi)誘導出大量的神經(jīng)前體細胞[10]。與此一致，本次體內(nèi)分化實驗顯示，在形成的畸胎瘤團塊中，外胚層組織所占的比例最大。

總之，孤雌激活胚胎干細胞系的建立，為胚胎干細胞的應用提供了更廣闊的前景，但是由于缺乏父源性基因印記，在分化潛能及定向誘導方面還需進一步研究。

[1]Lin H,Lei J,Wininger D,etal.Multilineage potentialofhomozygous stem cellsderived frommetaphaseⅡoocytes[J].Stem Cells,2003, 21(2):152-161.

[2]Karagenc L,Yalcin E,Ulug U,et al.Administration of increasing amountsofgonadotrophin compromisespreimplantation development ofparthenogeneticmouseembryos[J].Reprod Biomed Online,2004,8 (6):628-634.

[3]Hiypp J,Atala A.Tissue engineering,stem cells,cloning and parthenogenesis:new paradigms for therapy[J].JExp Clin Assist Reprod,2004,1(1):3.

[4]Sengoku K,Takuma N,Miyamato T,et al.Nuclear dynamics of parthenogenesis of human oocytes:effect of oocyte aging in vitro [J].Gynecol Obstet Invest,2004,58(3):155-159.

[5]Mizutani E,Jiang JY,Mizuno S,et al.Determination of optimal conditions for parthenogenetic activation and subsequent development of rat oocytes in vitro[J].JReprod Dev,2004,50(1):139-146.

[6]Pivko J,Landa V,Kubovicova E,et al.Comparativemorphometry of precompacted bovine embryos produced in vivo or in vitro after parthenogenetic activation and intracytoplasmic sperm injection (ICSI):ultrastructural analysis[J].Zygote,2003,11(3):207-217.

[7]舒益民,莊廣倫,周燦權(quán).Ca2+載體A23187對受精失敗人類成熟卵母細胞的補救激活作用[J].中國病理生理雜志,2003,19(2): 260-262.

[8]舒益民,莊廣倫,周燦權(quán).應用鈣離子載體A23187及6-甲基嘌呤對人卵母細胞進行孤雌激活[J].生殖醫(yī)學雜志,2002,11(3): 145-148.

[9]Newman-Smith ED,Werb Z.Stem cell defects in parthenogenetic peri-implantation embryos[J].Development,1995,121(7):2069-2077.

[10]韋多,王彥,高選,等.小鼠孤雌胚胎干細胞直接向神經(jīng)細胞誘導分化的實驗研究[J].山東大學學報醫(yī)學版,2008,46(5):445-448.

Creation of a M ouse Parthenogenetic Stem Cell Line

W ANG Yan1,QIAN Dejian1,WEIDuo2,XU Kai2,HUAN Qing2, LU Hong2,GAO Xuan2,CHEN Zijiang2.
1 Qianfoshan Hospital of Shandong Province,Ji′nan 250014,China;2 Center for Reproductive Medicine,Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Ji′nan 250021,China.Corresponding author:CHEN Zijiang.

ObjectiveTo creat a mouse parthenogenetic stem cell line by chemical activation.M ethodsMouse oocyteswere treated with A23187 and 6-DMAP,and then cultured till blastula embryos formed.Then the inner cellmass (ICM)cells were isolated,cultured,and passaged.Cells of the 37thpassage were examined by karyotyping to analyze chromosomes,microsatellite technique to determine homozygous genotype,immunohistochemistry to detect expression of specific cellmarkers,and teratogenic test to exhibitmulti-lineage potency.ResultsThe cells had a homozygous genotype and normal karyotype.The cellswere positive for alkaline phosphatase,Oct-4,and SSEA-1,and negative for SSEA-4.After injected into the SCID mice,the cells differentiated into three germ layers,and formed teratoma at the injection site.ConclusionAn embryonic stem cell line can be created by A23187 and 6-DMAP activation ofmouse oocytes.

Parthenogenetic;Embryonic stem cells;A23187;6-DMAP

book=132,ebook=13

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）03－0132－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.03.003

2010年2月28日；

2010年4月19日)

250014山東省濟南市山東省千佛山醫(yī)院（王彥，錢德儉）；250021山東省濟南市山東大學附屬山東省立醫(yī)院生殖醫(yī)學中心（韋多，徐凱，宦晴，呂鴻，高選，陳子江）。

陳子江。