快速純化新生大鼠許旺細胞的新方法

祝加學 沈尊理 秦金保 張濤 金羽青 周廣東

快速純化新生大鼠許旺細胞的新方法

祝加學 沈尊理 秦金保 張濤 金羽青 周廣東

目的探討一種簡單高效的許旺細胞純化方法。方法選用3～5 d的SD乳鼠雙側坐骨神經，用DispaseⅡ短時消化去除神經外膜和束膜，用復合膠原酶NB4徹底消化、離心，獲得原代細胞。細胞培養達到亞融合狀態后，置于4℃冰箱約5min，收集首先脫壁的許旺細胞。最后用S100免疫熒光法和流式細胞儀法鑒定許旺細胞的純度。結果通過酶消化法剝脫神經外膜和束膜，獲得純度85%以上的原代許旺細胞；經低溫差速法進一步純化，純度可達99%。結論先用酶消化神經外膜和束膜，再用低溫差速分離許旺細胞，能夠獲得高純度的許旺細胞，是一種簡便高效的純化手段。

許旺氏細胞純化低溫

許旺細胞是重要的神經膠質細胞，在中樞和外周神經損傷后的修復中發揮重要作用[1－4]。近年來的研究發現，許旺細胞與干細胞共培養可以促進干細胞分化為類神經細胞[5－7]，但是該方法需要高純度的許旺細胞。有兩種方法可以提高許旺細胞的純度：一是通過去除神經外膜提高原代細胞的純度；另一種是在培養傳代過程中，采取各種方法去除成纖維細胞的污染。但是這兩種方法都不能在短時間內獲得高純度的許旺細胞，而且具有耗資多、效率低等缺點。在提高原代許旺細胞純度方面，盡管在顯微鏡下剝離去除神經外膜，可以減少成纖維細胞的污染[11]，但是采用目前的設備技術，仍然難以達到徹底去除神經束膜的目的。乳鼠許旺細胞的增殖能力較成年鼠強，且取材容易，是許旺細胞研究的主要細胞來源，但是因為其神經細小，更難通過顯微技術去除外膜。而在許旺細胞的培養擴增過程中，主要的困難就是成纖維細胞的污染。針對這一問題，目前仍以有絲分裂抑制劑抑制成纖維細胞分裂法和酶消化差速貼壁法為主[8-10]。但是，有絲分裂劑對細胞的有絲分裂缺乏針對性，同樣也會抑制處于分裂旺盛期的許旺細胞增殖；酶消化差速貼壁法只是在培養傳代過程中減少成纖維細胞的污染，需要反復多次純化才能得到高純度的許旺細胞，因此酶消耗大、步驟繁瑣且耗時較長。

本研究嘗試先用DispaseⅡ酶消化法，去除乳鼠神經束膜和外膜，膠原酶消化分離獲得原代細胞，再用低溫差速分離法進一步純化，從原代和傳代兩個層面純化，以期在短時間內獲得高純度的許旺細胞。

1 材料與方法

1.1 動物

新生SD乳鼠（3～5日齡，上海斯萊克實驗動物有限公司）18只。

1.2 方法

1.2.1 培養瓶的鋪層

在培養瓶內加入含400 ng/mL層粘連蛋白（LN，羅氏公司）的DMEM溶液（100μl/cm2），水平振蕩培養瓶至液體均勻鋪滿瓶底，將培養瓶放入37℃、5%CO2細胞培養箱內孵育1 h，吸除液體后備用。

1.2.2 許旺細胞培養液的配制

許旺細胞培養液（Schwann cellsculturemedia，SCCM），含10%胎牛血清（FBS，Hyclone公司）的DMEM溶液，加入1mM左旋谷氨酰胺（Sigma公司）、2μM Forskolin（Sigma公司）、1 ng/mLHeregulin-β-1（Pepro Tech公司），混勻后，4℃冰箱保存備用。

1.2.3 原代許旺細胞的獲取

取新生3～5 d的小鼠，脫臼處死后，在75%乙醇內浸泡消毒15min。在解剖顯微鏡下手術獲取雙側坐骨神經（SN），將SN浸入裝有40mLPBS的50mL離心管中，冰上孵育待用。SN獲取完畢后，600 g離心，負壓吸除PBS，加入1 mL 0.2%DispaseⅡ，放入細胞培養箱內，37℃孵育30min。輕輕搖晃試管，使SN呈絲狀，自然沉淀后，吸去消化液（將消化液進行離心，所獲細胞種植于培養瓶中），PBS清洗1次，離心獲得絲狀的神經組織。加入0.2%復合膠原酶NB4放置30 min，徹底消化神經組織，用巴氏管反復吹打2～5min，至組織塊呈細微碎片（此時消化液較混濁，無明顯大組織塊）。600 g離心5 min，棄上清，加入SCCM重懸至（2.0～2.5）×105cells/mL，接種入LN鋪盤后的培養瓶培養。

1.2.4 許旺細胞的純化與擴增

原代細胞培養48 h后，將培養瓶放入4℃冰箱中，約5min后取出，輕輕拍打培養瓶壁1～3min，使許旺細胞脫離瓶壁入培養液中。收集懸液入15mL離心管，600 g離心5min，棄上清，加入SCCM，重懸細胞。1∶1接種于新的培養瓶繼續培養48 h。

1.2.5 許旺細胞的形態學鑒定

在培養瓶中，許旺細胞形態較特異，胞體細長呈梭形、雙極或三極、核漿比例小、折光性強，較易與胞體扁平不規則形、核漿比例較大、折光性差的成纖維細胞鑒別。此外，在體外培養中，相鄰的許旺細胞會首尾相連，形成鏈狀或網狀的特異形態，而成纖維細胞則相互融合呈片狀。

1.2.6 許旺細胞的免疫細胞化學鑒定

許旺細胞特異性表達S100β蛋白，可用以鑒定SC。負壓吸除SCCM，加入0.05%Trypsin-EDTA消化1min，FBS終止消化。600 g離心5min，棄上清，加適量SCCM，重懸細胞至（2.0～2.5）×106cells/mL。將細胞懸液滴于載玻片上，每張100μL，在37℃細胞培養箱內孵育30～40min后，加入適量SCCM培養24～48 h。負壓吸除SCCM，4%多聚甲醛溶液于室溫下固定5min。PBS漂洗3次，每次3min。10%羊血清室溫封閉10min。加入兔抗S100抗體（1∶500），37℃孵育60min或4℃過夜。PBS漂洗3次，每次5min。加入CY3-羊抗兔IgG抗體（1∶200），37℃孵育30min。PBS漂洗3次，每次5min。DAPI核襯染10 s，PBS漂洗5min。熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍攝。

1.2.7 流式細胞儀鑒定許旺細胞的純度

負壓吸除培養皿內培養液，PBS漂洗1次后加入3～4mL的0.05%Trypsin-EDTA，至大多數細胞收縮變圓、透亮時即加入30μL FBS（或含有10% FBS的培養液3mL）終止消化。將液體經40μm濾網過濾后，收集入50 mL離心管，600 g離心5 min，棄上清；用含4%FCS的PBS重懸至1.0×107cells/mL，每100μL分裝入一支15mL離心管中；分別加入兔抗P75（1∶500），4℃下避光孵育30 min。分別加入含4%FCS的PBS漂洗，600 g離心5min，棄上清，重復漂洗3次。用100μL含4%FCS的PBS重懸細胞，加入二抗FITC-羊抗兔IgG抗體（1∶500，PBS稀釋），4℃下避光孵育30min。分別加入10mL含4%FCS的PBS漂洗，600 g離心5 min，棄上清，重復漂洗3次。用含4%FCS的PBS重懸細胞，冰上孵育待測。

1.2.8 細胞計數

取每次純化所得的細胞懸液各20μL，以血細胞計數板進行細胞計數，此時獲得的為純化后所得的細胞量。第60小時，用0.05%Trypsin-EDTA消化1～3 min，以獲得所有的貼壁細胞；細胞懸液收集后，取20μL用血細胞計數板進行細胞計數，此時所得為最終的細胞獲得量。

1.3 統計學方法

每次實驗種6瓶細胞，3瓶一組，共進行3次實驗。原代細胞與純化后的第1代細胞進行純度比較，計數值以均數±標準差表示，應用SPSS 10.0統計軟件進行數據分析。組間均數比較采用t檢驗，P＜0.01為差異具有顯著意義。

2 結果

2.1 許旺細胞的獲取與原代培養

經酶及機械消化后，所獲得的細胞接種于LN鋪盤后的培養瓶，6 h后即見絕大多數細胞已經貼壁。隨著進一步培養，貼壁細胞逐漸伸展，最終形成兩類形態各異的細胞：一類為許旺細胞，胞體較小，呈梭形，雙極或三極，核漿比例小，胞核橢圓形，胞體折光性強；另一類為成纖維細胞，細胞較大，呈扁平多邊或不規則形，核漿比例大，胞核圓而大，胞體折光性差。在前48 h的培養過程中，許旺細胞的分裂速度明顯快于成纖維細胞；72 h后，成纖維細胞增殖加快，并迅速成為優勢生長的細胞而鋪滿瓶底，此時多數許旺細胞被迫遷移并重疊到成纖維細胞的上方。上清液離心所獲得細胞中以成纖維細胞為主，只有極少量許旺細胞（圖1）。

圖1 原代細胞的顯微鏡下觀察（綠色箭頭所示為許旺細胞，紅色箭頭所示為成纖維細胞）

2.2 許旺細胞的純化

將培養瓶置于4℃冰箱中約5 min后，倒置相差顯微鏡下觀察：大多數雙極和三極的細胞收縮，折光性明顯增加；而成纖維細胞則形態學改變不明顯并貼壁牢固。輕輕拍打瓶壁1～3min，見大多數許旺細胞浮起，而成纖維細胞仍然貼壁完好（圖2）。

圖2 純化過程中細胞的顯微鏡下觀察（綠色箭頭所示為許旺細胞，紅色箭頭所示為成纖維細胞）

2.3 許旺細胞的鑒定

經體外繼續培養的許旺細胞，在3 d后大多排列成鏈狀或網狀。經S100β蛋白的免疫熒光染色，發現幾乎所有的雙極及三極樣細胞為陽性，而殘余的扁平圓核不規則細胞均為陰性（圖3）。

圖3 細胞的免疫熒光染色（40×）（綠色箭頭所示為許旺細胞，白色箭頭所示為成纖維細胞）

2.4 許旺細胞的純度鑒定

原代許旺細胞貼壁24 h，許旺細胞的純度為85%；原代細胞培養48 h，經過進一步純化后，再次貼壁24 h，許旺細胞的純度為99.6%（圖4）。

圖4 實驗組和對照組的流式細胞檢測

2.5 細胞擴增計數

重復3次實驗，二次純化所得的許旺細胞純度均高于99%。第1代細胞的純度均顯著高于原代，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

3 討論

許旺細胞的體內、外研究及組織工程化神經導管的構建都需要制備高純度的許旺細胞[2，4]，而且高純度許旺細胞與間充質干細胞共培養可誘導出類神經元[5－7]。然而，在許旺細胞的體外培養中，成纖維細胞的優勢生長一直都是制約許旺細胞體外培養純化的主要因素。盡管目前已有許多許旺細胞的純化方法，如無血清或低血清培養法[12]、抗有絲分裂處理結合胰酶差速消化法[13]、免疫選擇法、復合膠原酶差速消化法及體外預變性結合復合膠原酶差速消化法[9－10]等，然而這些方法各有缺點。無血清或低血清培養法，不僅降低成纖維細胞的增殖，許旺細胞的增殖也明顯受到抑制。抗有絲分裂劑，非特異地作用于所有的進行有絲分裂的細胞，因而在減少快速增殖的成纖維細胞的同時，也抑制了處于有絲分裂旺盛期的許旺細胞增殖。免疫選擇法，需要大量抗體及大型分選設備，增加了細胞污染的概率，耗費資金較多[14]。而各類消化酶差速消化法及體外預變性的方法，大多費時較長，難以在短時間內獲得大量高純度的許旺細胞。

我們通過DispaseⅡ初步消化神經，去除神經外膜和束膜，可獲得相對較高純度的原代許旺細胞，再利用許旺細胞和成纖維細胞對低溫作用的不同反應，通過降低培養瓶內的溫度，促使許旺細胞首先脫壁，進一步純化許旺細胞，可使許旺細胞的純度達到99%以上。采用以上方法，可以在短時間內獲得高純度的許旺細胞，且較經濟方便。為驗證DispaseⅡ對神經外膜和束膜的消化具有特異性，我們將首次酶消化過程中獲得的混合液離心，所得細胞種植于培養瓶中培養，發現只有少量許旺細胞，因此DispaseII對神經段的消化，不會造成許旺細胞的大量丟失。在純化原代許旺細胞過程中，需要嚴格控制培養瓶放置入冰箱的時間：作用時間過短，許旺細胞不脫壁；而作用時間過長，成纖維細胞也會大量脫壁，達不到純化目的。我們發現，作用5min左右比較合適。

綜上所述，我們用DispaseⅡ消化去除神經外膜和束膜，可以獲得高純度的原代許旺細胞，首次傳代時再用低溫差速分離法進一步純化，在48 h內就能獲得滿足需要的高純度許旺細胞。

[1]Aszmann OC.The lifeand work of Theodore Schwann[J].JReconstr Microsurg,2000,16:291-295.

[2]王碧菠,戴傳昌.周圍神經缺損的組織工程修復進展[J].組織工程與重建外科雜志,2006,2(2):113-115.

[3]盧慕峻,祁佐良,戴傳昌.嗅神經鞘細胞與雪旺氏細胞在脊髓損傷修復中的作用[J].上海第二醫科大學學報,2005,25(3):301-304.

[4]戴傳昌,商慶新,王煒,等.用組織工程方法橋接周圍神經缺損的實驗研究[J].中華外科雜志,2000,38(5):388-390.

[5]Zurita M,Vaquero J,Oya S,etal.Schwann cells induce neuronal differentiation of bonemarrow stromal cells[J].Neuroreport,2005, 16(5):505-508.

[6]Zurita M,Vaquero J,Oya S,et al.Neurotrophic Schwann-cell factors induce neural direntiation of bonemarrow stromal cells[J]. Neuroreport,2007,18(16):1713-1717.

[7]Yang J,Lou Q,Huang R,etal.Dorsal rootganglion neurons induce transdifferentiation ofmesenchymal stemcells along a Schwann cell lineage[J].Neurosci Lett,2008,445(3):246-251.

[8]洪坦輝,金羽青,戴傳昌,等.復合膠原酶消化法制備高純度小鼠雪旺細胞[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4(5):259-287.

[9]Jin YQ,Liu W,Hong TH,et al.Efficient Schwann cell purification by differential celldetachmentusingmultiplex collagenase treatment [J].JNeurosciMethods,2008,170(1):140-148.

[10]Wu W,Jin YQ,Kretlow JD,et al.Purification of Schwann cells from adult rats by differential detachment[J].Biotechnol Lett, 2009,31(11):1703-1708.

[11]勞杰,熊良儉,顧玉東,等.復合膠原酶消化法制備高純度小鼠雪旺細胞[J].中華手外科雜志,1999,15(2):106-108.

[12]Needham LK,Tennekoon GI,McKhann GM.Selective growth of rat Schwann cells in neuron-and serum-free Primary culture[J]. JNeurosci,1987,7(l):1-9.

[13]Wei Y,Zhou J,Zheng Z,et al.An improved method for isolating Schwann cells from postnatal rat sciatic nerves[J].Cell Tissue Res, 2009,337(3):361-369.

[14]Vroemen M,Weidner N.Purification of Schwann cells by selection of p75 low affinity nerve growth factor receptor expressing cells from adult peripheral nerve[J].JNeurosciMethods,2003,124(2): 135-143.

A Novel Approach to Rapid and High-efficiency Purification of Schwann Cells in Rats

ZHU Jiaxue1,SHEN Zunli1, QIN Jinbao1,ZHANG Tao2,JIN Yuqin1,ZHOU Guangdong3.
1 Department of Plastic Surgery,Shanghai First People′s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200080,China;2 Department of Gynaecology and Obstetrics,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200111,China;3 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai200111,China.Corresponding author:SHEN Zunli.

ObjectiveTo explore a simplemethod for high-purity enrichmentof Schwann cells(SCs).M ethodsThe sciatic nervewas dissected from both limbs of the neonatal Sprague-Dawley(SD)rat(3－5 days old).The nervewas first digested by dispaseⅡto remove epineurium and perineurium,and then by collagenase NB4 to obtain primary SCs.The cells were centrifuged and cultured until confluence in a flask.Then the flask was placed in refrigerator(4℃)for 5 minutes.At such a low temperature,SCsmostly detached from the innerwall,while the other cells remained adherent.The SC purity was identified by S100 immunofluorescence double staining and flow cytometry.ResultsThe purity was above 85%after enzyme digestion,and reached 99%after low-temperature treatment.ConclusionEnzyme digestion in conjunction with low temperature treatment is a simple and efficientway to obtain Schwann cellswith high purity.

Schwann cells;Purification;Low-temperature

book=141,ebook=5

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）03－0141－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.03.005

2010年3月16日；

2010年3月23日)

國家自然科學基金（30872630）。

200080上海市上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院整形外科（祝加學，沈尊理，秦金保，金羽青）；200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院婦產科（張濤）；整復外科（周廣東）。

沈尊理。