鼻咽癌細胞雞胚絨毛尿囊膜移植瘤模型的建立△

李 萍 張 哲 韋祝新 張錦艷

(1廣西醫科大學基礎醫學院,南寧市 530021;2廣西醫科大學第一附屬醫院,南寧市 530021)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)在中國兩廣地區高發,60%～70%的患者就診時已是Ⅲ、Ⅳ期,中晚期患者因較高的局部復發率和轉移率導致總生存率偏低[1]。鼻咽癌的臨床標本獲取比較有限,這對開展鼻咽癌生物學行為的研究極為不利。目前常用的鼻咽癌動物模型是裸鼠移植腫瘤模型,該模型實驗條件要求高,且實驗周期長,費用昂貴。雞胚尿囊膜模型是最近開發的移植瘤模型之一,具有簡單、方便、價廉、快速等優點,國內外已有學者把該項技術應用于黑色素瘤[2]、神經母細胞瘤[3]、子宮內膜腺癌[4]等腫瘤的研究。但用于鼻咽癌研究的尚未見報道。本課題旨在研究鼻咽癌雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)模型的建立,為今后進一步開展有關鼻咽癌的研究創建技術平臺。

1 材料與方法

1.1 材料 鼻咽癌細胞株 5-8F購自中南大學湘雅醫學院中心實驗室細胞庫 。受精種蛋購自南寧市良鳳農牧有限責任公司(原南寧市養雞廠),為良鳳花雞雞種。

1.2 方法 制作雞胚模型的方法:8日齡雞胚在照卵器照射下用鉛筆在蛋殼表面勾畫出氣室、胚體及 CAM上大血管位置;于超凈工作臺上用轉孔器在蛋殼表面“開窗”,對數生長期鼻咽癌細胞懸液滴加于CAM,無菌透明輔料封閉方窗;胚蛋放回孵箱繼續孵育。在此基礎上,分別接種 0.25×106、0.5×106、1×106、2×106個 NPC細胞及對照組(IMDM培養基)于雞胚,從孵育 24 h起,每隔 24 h對胚蛋進行原位數碼攝影。共孵育 120h,分離移植瘤瘤體,測量其直徑及厚度,計算腫瘤體積,并行組織切片HE染色。

1.3 統計學處理 應用 SPSS 12.0軟件進行處理。兩樣本均數檢驗采用獨立樣本 t檢驗,以 P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NPC細胞CAM模型最佳接種條件的確定 根據雞胚孵化的特點,確定最佳的接種時間為雞胚孵至第 8日齡,終止時間為雞胚孵至第 14日齡。以“開窗法”為鼻咽癌的最佳接種CAM的方法,以硅膠圈為最佳的接種癌細胞的載體。按照以上接種條件,我們對接種NPC細胞的胚蛋進行原位數碼攝影。從圖1中可以看到,接種 72 h后,在雞胚 CAM膜上已出現了明顯的瘤體,瘤體稍隆起于 CAM膜,邊界清楚,周圍 CAM膜變粗糙,并可見小血管以瘤體為中心放射狀的生長。對照組中未見移植瘤生長。HE染色切片可見,鼻咽癌細胞以 CAM膜為細胞外基質生長,形成癌巢;癌細胞大小不一,核漿比例升高,核染色深,核仁清楚,病理性核分裂像多見(3～8個/高倍視野),呈明顯的低分化癌的特征(見圖2)。這些均符合鼻咽癌體內生長的模式。

圖1 大體形態觀察 0.5×106個鼻咽癌細胞接種 CAM 72 h移植瘤的生長

2.2 適宜接種細胞數目的確定

2.2.1 確定 NPC細胞在CAM成瘤的最小接種數目 以腫瘤直徑達到或超過 2mm為成瘤陽性。從表1可見,接種細胞數為 0.25×106時,雖有移植瘤形成,但成瘤率未達到 100%;而接種細胞數達到或超過 0.5×106時,成瘤率達到了 100%。因此,NPC細胞在 CAM成瘤的最小接種細胞數為 0.25×106。

表1 在 CAM上接種不同細胞數鼻咽癌細胞后移植瘤成瘤情況

2.2.2 確定 NPC細胞在CAM成瘤的適宜接種細胞數 從表2及圖3中可以看出,當接種細胞數較小時,即 0.25×106和0.5×106,形成的移植瘤體積較小;當接種細胞數達到 1×106時,移植瘤的體積顯著增大(P<0.05)。當接種數量達到 2×106個細胞時,移植瘤體積還有所增大。但同時移植瘤中心出現明顯的壞死,這一點經切片觀察也得到證實。故鼻咽癌細胞在 CAM上的適宜成瘤接種細胞數是 0.5×106～1×106。

圖2 鼻咽癌細胞接種 CAM膜組織HE切片觀察(HE 40×10)

表2 CAM上接種不同細胞數鼻咽癌細胞 120 h移植瘤體積

圖3 CAM上接種不同細胞數鼻咽癌細胞 120 h后移植瘤瘤體觀察

3 討 論

近代,雞胚材料在多個研究領域和方向被大量的應用,主要原因是雞胚的免疫力低,適合異種細胞的生長。此外,雞胚具有簡便、經濟、實驗周期短、不需要特殊設備的特點,因此在一般實驗室即可開展。目前雞胚已經普遍應用于發育學[5]、病毒學[6]、寄生蟲學(如原蟲[7]),以及一些腫瘤和非腫瘤性疾病(如子宮內膜異位癥[8])的研究中。而在所有應用雞胚材料的實驗中,CAM在腫瘤學方面的研究,是其中的一個熱點。

雞胚的發育期是 20～21 d,在雞胚尿囊發育過程中,尿囊體壁中胚層與絨毛膜臟壁中胚層融合形成絨毛尿囊膜 CAM。絨毛尿囊膜與外方的多孔外殼緊貼的特點以及其中豐富的毛細血管叢,保證了最高水平的氣體和營養交換,這使得絨毛尿囊膜成為雞胚的重要呼吸器官。同時也因這一特點使它能有效地支持組織移植物的生長,這些均使雞胚絨毛尿囊膜成為研究腫瘤的良好動物模型。

為了建立好鼻咽癌雞胚絨毛尿囊膜模型,我們對模型制作手法和接種條件進行了優化。首先是制作方法的選擇,常用的建立雞胚尿囊膜模型的方法有兩種:無殼法和窗法。無殼法是 Auerbach教授于1974年創立的[9],國外許多學者提倡使用此方法,認為它易于動態觀察。我們發現無殼法培養雞胚死亡率較高,且在南方的潮濕環境下雞胚易于感染。而窗法有相對易于操作、成瘤率高等優點,因此確立了使用窗法作為模型建立的方法。經過反復摸索,我們掌握了給雞胚“開窗”的最佳方法,使雞胚“開窗”成功率接近 100%。其次在載體的選擇方面,由于在已建立的各種腫瘤雞胚 CAM模型中,對于載體的使用沒有統一的標準,我們嘗試了文獻報道的多種載體,包括甲基纖維素膜、明膠海綿、硅膠圈和無載體細胞懸液直接滴注等方法。經過大量實驗摸索,我們認為對于一定量內的癌細胞接種,以硅膠圈法最為理想,其可通過限定一定的接種表面積及體積保證實驗的同一性。然而對于活檢的原代組織的接種,直接接種是較好的方法。在接種時間的選擇上,由于雞胚發育的特點是:在孵育的第 6天,尿囊急劇增大與漿膜相貼愈合,形成尿囊絨毛膜;至孵育的第 8天,尿囊較第 7天擴大了一倍,幾乎包圍了卵黃囊。因此我們選擇的接種時間是雞胚孵至 8日齡時。根據雞胚免疫器官發育的特點:孵化到第 2周時,雞胚胸腺中的淋巴細胞就可出現宿主抗移植物反應[10],故此我們選擇的實驗終止時間是最遲至雞胚孵育的第 14日齡。經過對實驗手法的摸索,我們接種鼻咽癌細胞于 CAM膜上,成功地使之在CAM上形成移植瘤。通過原位攝影,我們觀察了移植瘤出現、形成和發展的過程。顯微鏡下,癌細胞侵襲浸潤 CAM膜;CAM膜內的癌細胞排列方式恢復為與人體內一致的巢狀結構,同時癌細胞保持低分化癌的形態,充分說明鼻咽癌CAM移植瘤可模擬鼻咽癌人體內生長模式。

除了對以上條件進行摸索和優化,我們進一步還要優化癌細胞的接種數,以確保成瘤率及腫瘤的有效生長。不同的腫瘤細胞 CAM膜移植成瘤能力不同。有資料表明,前列腺癌細胞株[11]、黑色素瘤細胞株[12]接種細胞數在 105～106之間就可有較好的腫瘤組織形成能力。而卵巢癌細胞須在細胞數達到 107～108時才能形成移植瘤[13]。我們發現當接種鼻咽癌細胞數在 0.25×106時雖可成瘤,但成瘤率未達 100%;當接種細胞數在 0.5×106及以上時,成瘤率方達 100%。此外,接種 0.25×106個鼻咽癌細胞時,形成的移植瘤體積較小。隨著接種細胞數目的增加,形成移植瘤的體積有所增大。能引起移植瘤體積顯著增加的接種細胞數為 1×106。而當接種細胞數增加至 2×106時移植瘤中心出現明顯壞死。從以上結果可以看出,人鼻咽癌細胞株的適宜接種細胞數為 0.5～1×106個細胞/只雞胚。

我們摸索出了建立鼻咽癌細胞CAM移植瘤的成熟條件,成功地建立了鼻咽癌CAM移植瘤模型,為開展鼻咽癌的生物學行為研究奠定了又一個技術平臺,對防治鼻咽癌的工作具有重要意義。

[1] 何曉洪,王洪乾.Ⅲ、Ⅳa期鼻咽癌同步放化療加輔助化療的臨床分析[J].微創醫學,2009,4(2):179-180.

[2] Takigawa M,Enomoto M,Nishida Y,et al.Tumor angiogenesis and polyam ines:alpha-difluoromethylornithine,an irreversible inhibitor of ornithine decarboxylase,inhibits B16melanoma-induced angiogenesis in ovo and the proliferation ofvascular endothelial cells in vitro[J].Cancer Res,1990,50(13):4131-4138.

[3] Ribatti D,Raffaghello L,Pastorino F,et al.In vivo angiogenic activity of neuroblastoma correlates with MYCN oncogene over expression[J].Int JCancer,2002,102(4):351-354.

[4] Palczak R,Splawinski J.Angiogenicactivity and neovascularization in adenocarcinoma ofendometrium[J].Int JGynaecol Obstet,1989,29(4):343-357.

[5] Morgan BA,Izpisua-Belmonte JC,Duboule D,et al.Targeted m isexpression of Hox-4.6 in the avian limb bud causesapparent homeotic transformations[J].Nature,1992,358(6383):236-239.

[6] MaW,Brenner D,Wang Z,et al.The NSsegmentofan H 5N 1highly pathogenic avian influenza virus(HPAIV)is sufficient to alter replication efficiency,cell tropism,and host range of an H 7N 1 HPA IV[J].JVirol,2010,84(4):2122-2133.

[7] Lindsay DS,Sundermann CA,Blagburn BL.Cultivation of cryptosporidium baileyi:studieswith cellcultures,avian embryos,and pathogenicity of chicken embryo-passaged oocysts[J].J Parasitol,1988,74(2):288-293.

[8] Nap AW,Dunselman GA,Griffioen AW,et al.Angiostatic agents prevent the development of endometriosis-like lesions in the chicken chorioallantoicmembrane[J].Fertil Steril,2005,83(3):793-795.

[9] Auerbach R,Kubai L,Knighton D,et al.A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos[J].Dev Biol,1974,41(2):391-394.

[10] 鮑恩東,陳萬芳.雞胚免疫系統器官組織學變化觀察[J].中國獸醫科技,1996,26(2):26-27.

[11] Kunzi-Rapp K,Genze F,Kufer R,et al.Chorioallantoic membrane assay:vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model[J].J Urol,2001,166(4):1502-1507.

[12] Mousa SS,Mousa SS,Mousa SA.Effect of resveratrol on angiogenesis and platelet/fibrin-accelerated tumor growth in the chick chorioallantoicmembranemodel[J].Nutr Cancer,2005,52(1):59-65.

[13] 楊麗華,王凱峰,周軼萍,等.人卵巢癌雞胚尿囊膜血管生成模型的建立[J].現代婦產科進展,2003,12(6):407-409.