CAIX在NSCLC中的表達及其與VEGF和Ki67表達的相關性

趙向飛 劉曉晴 郭萬峰 李曉兵

碳酸酐酶IX（carbonic anhydrase IX, CAIX）是新發現的碳酸酐酶家族的異構體之一，與腫瘤的乏氧代謝密切相關。細胞核增殖抗原（proliferating cell nuclear antigen,Ki67） 的表達出現于除G0期、G1期早期以外的細胞周期中，被認為是能較可靠、全面地反映細胞群體增殖活性的客觀指標；血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）與腫瘤血管生成呈正相關。目前國內外關于CAIX在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中的表達及其與Ki67、VEGF表達的相關性研究較少，尤其是CAIX表達與肺癌治療的相關性尚未見報道。本實驗使用免疫組化的方法檢測CAIX蛋白在NSCLC組織中的表達情況，分析其與放療及增殖指標Ki67、血管增生指標VEGF的相關性，研究CAIX與NSCLC發病及治療的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院肺癌內科1999年1月-2005年12月住院治療并經病理證實的NSCLC 76例，男性53例，女性23例。年齡30歲-75歲，中位年齡59歲。其中腺癌43例，鱗癌33例；低分化43例，中分化16例，高分化17例；分期：I期/II期13例，III期/IV期63例；接受放療患者34例。患者均為初治患者。另取10例炎性假瘤標本作為陰性對照。

1.2 治療方法 放療方案為胸部病灶放療劑量為60 Gy-72 Gy，頸、鎖骨上淋巴結轉移灶為60 Gy-70 Gy，腦轉移灶為38 Gy-52 Gy，放療方式為常規放療與適形或調強放療，分割方式有常規分割、超分割與低分割。部分放療患者聯合含鉑類方案化療。

1.3 主要試劑 兔抗人CAIX單抗、鼠抗人VEGF單抗、兔抗人Ki67單抗及PV-8000免疫組化試劑盒均購自北京中杉生物技術有限公司。CAIX工作濃度為1:50，稀釋劑為PBS；VEGF、Ki67工作濃度為1:100，稀釋劑為PBS。

1.4 實驗方法 采用免疫組化SP法，標本切片為4 μm，經脫蠟、脫苯、水化后進行高壓抗原修復，滴加抗體后置于4oC冰箱過夜。用已知染色陽性的膽囊上皮切片作為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.5 免疫組化結果判斷 所有樣本均經過兩位病理醫師進行評估。CAIX蛋白以細胞膜呈棕黃色為陽性標記（圖1A1和圖1B2），VEGF以胞漿呈棕黃色顆粒為陽性標記（圖1A2和圖1B2），Ki67以胞核呈棕黃色顆粒為陽性標記（圖1A3和圖1B3），結果判斷采用半定量積分法，在高倍鏡下隨機選擇5個視野，每個視野計數200個細胞，共計1 000個，計算每張切片陽性細胞百分率，根據切片上陽性細胞所占百分比計分。陽性細胞≤5%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分；顯色度按細胞著色深淺計分：0分細胞無著色，1分淺黃色，2分棕黃色，3分棕褐色。兩者積分相乘，0分-4分為陰性，5分-12分為陽性。

1.6 療效評價標準 按照世界衛生組織（WHO）抗腫瘤治療的客觀療效標準進行評價。完全緩解（complete response, CR）：完全消失，無新病灶，無疾病相關癥狀，至少持續4周；部分緩解（partial response, PR）：與基線相比，病灶兩個最大垂直橫徑乘積總和減少＞50%，且持續4周；穩定（stable disease, SD）：與基線相比，未達CR、PR，無疾病進展，無新病灶形成；進展（progressive disease, PD）：與基線相比，病灶兩個最大垂直橫徑乘積增大＞25%，或任何可評估的病灶出現惡化或發現新病灶。以療效CR+PR為有效組，療效SD+PD為無效組。

1.7 統計學分析 采用SPSS 11.5軟件對數據進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，均數比較采用t檢驗，等級相關用Spearman分析，以P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 NSCLC及炎性假瘤組織中CAIX蛋白的表達 76例NSCLC組織中，35例CAIX表達呈陽性，陽性率為46.1%，而在良性病變炎性假瘤組中無表達，兩者差異有統計學意義（P＜0.001）。

2.2 CAIX蛋白在NSCLC中的表達 CAIX蛋白表達在鱗癌組的陽性率為23/33（69.7%），明顯高于腺癌組12/43（27.9%），差異有統計學意義（P=0.001）；CAIX蛋白表達在不同分化程度之間差異具有統計學意義（P=0.005）；但CAIX蛋白表達在性別、年齡、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移、吸煙、體重下降各組間表達差異無統計學意義（表1）。

2.3 CAIX蛋白表達與放療療效的相關性 CAIX陽性組18例，客觀反應率（objective response rate, ORR）（CR+PR）為27.8%，CAIX陰性組16例，陽性例數13例，陽性率62.5%，兩組相比差異有統計學意義（P=0.042）（表2）。

2.4 NSCLC中VEGF和Ki67的表達與臨床病理因素的關系76例NSCLC組織中，55例VEGF表達呈陽性，陽性率為72.4%，與是否存在體重下降具有相關性（P=0.016），在性別、年齡、組織學類型、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移、吸煙、KPS評分方面，各組間表達差異無統計學意義。在76例NSCLC組織中有32例Ki67表達陽性，陽性率為42.1%，在性別、年齡、組織學類型、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移、吸煙、KPS評分、體重下降方面，各組間表達差異均無統計學意義。

表 1 CAIX與NSCLC患者臨床病理特征相關性Fig 1 Relationship between expression of CAIX with clinicopathologic characteristics in NSCLC

2.5 NSCLC組織中CAIX蛋白表達與VEGF、Ki67表達的相關性 76例NSCLC組織中，55例患者VEGF表達陽性，其中CAIX表達陽性者為29例（52.7%），在VEGF表達陰性的21例患者中，CAIX表達陽性者為16例，二者表達呈正相關（r=0.231, P=0.043）；CAIX和Ki67共同表達陽性者為15例，在Ki67表達陰性的46例中，CAIX表達陽性者為20例，二者表達無相關性（r=0.064, P=0.583）（表3，表4）。

3 討論

CAIX最早被稱為MN蛋白，是1993年由Pastorekova在與人乳腺癌細胞聯合培養的人宮頸癌的HeLa細胞系中發現的[1]。CAIX蛋白在正常人上消化道及消化道相關器官如胰腺、膽囊、肝臟中大量表達，正常人心臟、肺、腎、前列腺、外周血、腦、胎盤及肌肉組織中不表達CAIX[2]。CAIX在NSCLC中的表達情況報道不一，現有的文獻[3-5]報道，CAIX蛋白在NSCLC組織中的表達陽性率為36.4%-81%，我們的研究使用免疫組化的方法檢測CAIX在NSCLC中的表達，結果顯示在NSCLC患者中CAIX表達陽性率達46.1%，10例良性病變無一例存在CAIX表達，提示CAIX有作為臨床肺部病變鑒別良惡性指標的潛力，鱗癌患者陽性率明顯高于腺癌患者，這與Giatromanolaki研究[5]的結果是一致的，在不同的分化程度的患者中，CAIX表達陽性率也有差異，表明CAIX與NSCLC的發生或發展存在相關性。CAIX的表達與腫瘤的乏氧代謝密切相關，在實體腫瘤中，多數腫瘤細胞生長迅速，血管的生長速度相對滯后，以致內部腫瘤細胞供血不足，導致腫瘤細胞乏氧，古模發[6]使用乏氧組織顯像劑99mTc-HL91對照檢測了41例肺癌患者和33例非肺癌患者，發現對照組33例均為無明顯乏氧；肺癌組則無明顯乏氧0例，低度乏氧18例，高度乏氧23例，各組分布有明顯差異。Le[7]在早期NSCLC患者術中直接用電極測量癌組織的氧濃度，分析了其與肺癌組織CAIX蛋白表達的關系，發現二者存在負相關，認為在NSCLC中CAIX表達與乏氧相關，可以作為乏氧代謝的觀測指標。在我們的研究中，CAIX表達與NSCLC的相關性間接提示了NSCLC組織中存在乏氧，鱗癌患者腫瘤組織中乏氧存在的比例可能高于腺癌患者。

圖 1 CAIX、VEGF和Ki67在肺腺癌及肺鱗癌組織中的表達。A：腺癌；B：鱗癌；1：CAIX（+）；2：VEGF（+）；3：Ki67（+）。A1：SP，×200；A2：SP，×400；A3：SP，×200；B1：SP，×200；B2：SP，×400；B3：SP，×200。Fig 1 The expression of CAIX, VEGF and Ki67 in NSCLC. A: adenocarcinoma; B: squamous cell carcinoma; 1: CAIX (+); 2: VEGF (+); 3: Ki67 (+). A1: SP, ×200; A2: SP, ×400; A3: SP, ×200; B1: SP, ×200; B2: SP, ×400; B3: SP, ×200.

表 2 CAIX表達與放療療效客觀反應率的相關性Fig 2 Relationship between expression of CAIX with ORR of radiotherapy in NSCLC

表 3 CAIX蛋白表達與VEGF表達的相關性Fig 3 Relationship between expression of CAIX with VEGF in NSCLC

表 4 CAIX蛋白表達與Ki67表達的相關性Fig 4 Relationship between expression of CAIX with Ki67 in NSCLC

乏氧是導致實體腫瘤治療抵抗的重要原因，我們進一步研究了CAIX表達與NSCLC放療療效的相關性。近來的研究[8]表明NSCLC患者CAIX表達與生存期相關，但尚無研究分析其與治療療效的關系，我們的研究發現放療療效的客觀反應率在CAIX表達陽性組和陰性組之間的差異有統計學意義，國外研究[10]發現在頭頸部鱗癌中CAIX表達與放療療效具有相關性，本研究顯示CAIX陰性組的客觀反應率明顯高于CAIX陽性組，提示CAIX表達陽性對放療療效可能存在一定的預測作用，由于CAIX表達與乏氧代謝的密切相關性，本研究為乏氧增加NSCLC的放療抵抗提供了新的證據。

乏氧可使腫瘤細胞的一些基因和蛋白的表達發生改變，包括CAIX、VEGF在內的多個基因表達的上調[11]。在Kim的研究[8]中，使用RT-PCR技術檢測了74例早期NSCLC患者的術后切除標本中CAIX和VEGF的表達，發現CAIX mRNA的表達與VEGF mRNA呈正相關（P=0.002），本研究發現CAIX蛋白表達與VEGF蛋白表達呈正相關，與Kim的研究結論一致，提示在NSCLC中VEGF的表達可能與乏氧相關。CAIX與VEGF表達的正相關關系可能是由于它們結構的側鏈均存在一個乏氧反應元件（hypoxia-responsive element, HRE），可以在乏氧的條件下被激活，從而使表達共同上調[12]，而不是線性的激活與被激活的關系。多個研究[13,14]表明在腎癌、乳腺癌中CAIX的表達與Ki67表達相關，但我們的研究卻發現在NSCLC患者中CAIX表達與Ki67表達差異無統計學意義，在Kim的另外一個研究[15]中也發現在75例NSCLC患者中CAIX表達與Ki67表達差異無統計學意義，但對CAIX高表達的30例患者分析發現，CAIX染色陽性區域較陰性區域有更高比例的Ki67表達，提示CAIX表達有助于腫瘤細胞的增殖，本研究因CAIX（+++）表達例數僅10例，故未進行此項觀察。

本研究的結果表明：CAIX在NSCLC組織中表達較良性組織水平明顯上升，并與VEGF表達相關；CAIX蛋白表達與客觀反應率相關，為乏氧增加NSCLC的放療抵抗提供了新的證據。