DNMT1高表達與beta-catenin蓄積及肺鱗癌、腺癌的惡性表型相關

徐洪濤 王佐周 劉娣 李慶昌 戴順東 王恩華

作者單位：110001 沈陽，中國醫科大學基礎醫學院病理學教研室（通訊作者：徐洪濤，E-mail: xu.htao@yahoo.com.cn）

DNA甲基化是導致抑癌基因失活和腫瘤發生發展的重要表觀遺傳學因素，在肺癌中已發現CDH1（E-cadherin）、p16、p53、PTEN、RB等多種抑癌基因的甲基化[1]。DNA甲基轉移酶1（DNA methyltransferase 1,DNMT1）是調控CpG二核苷酸中胞嘧啶甲基化的重要分子之一，研究表明，DNMT1的異常表達與結腸癌[2]、乳腺癌[3]、胰腺癌[4]等多種惡性腫瘤的發生發展有關。但目前有關DNMT1在肺癌中表達和作用的研究尚處于起步階段，DNMT1在肺鱗癌、腺癌中的表達情況和意義尚不明確。β-連環蛋白（β-catenin）作為細胞粘附和Wnt通路的關鍵分子，與肺癌的發生發展和侵襲轉移關系密切[5]。而DNMT1與β-catenin在肺癌中是否存在某些聯系和相互作用尚不明確。為此，本研究采用組織芯片和免疫組化方法檢測DNMT1在肺鱗癌、腺癌和癌旁正常肺組織中的表達情況，分析闡明DNMT1在正常肺組織和肺癌組織中表達的差異及其與肺鱗癌和腺癌臨床病理因素的關系，并探討DNMT1與β-catenin在肺癌中表達的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例與標本 84例肺鱗癌、腺癌和相對應的84例癌旁正常肺組織標本取自上海芯超生物科技有限公司組織庫存檔標本（由醫院合作方提供），癌旁正常肺組織的取材部位距離癌灶1 cm-2 cm，由上海芯超公司的病理專家根據WHO（2004年）肺腫瘤組織學分類標準復診確認并制備組織芯片（陣列編號：OD-CT-RsLug01-002），每例標本直徑1.0 mm。根據存檔資料，患者平均年齡（61.21±11.74）歲（20歲-81歲）（3例年齡信息缺失），男性49例，女性33例（2例性別信息缺失），術前均未接受放化療。肺癌組織根據WHO（2004年）肺腫瘤組織學分類標準分為鱗癌37例（包括高分化14例、中分化14例、低分化9例）；腺癌47例（包括高分化12例、中分化27例、低分化8例），75例腫瘤最大直徑≥3 cm，35例存在淋巴結轉移。

1.1.2 試劑 鼠抗人DNMT1單克隆抗體（sc-70981）購自美國Santa Cruz生物技術公司，鼠抗人β-catenin單克隆抗體（610153）購自美國BD Transduction Laboratories，SP超敏免疫組化試劑盒（KIT-9710）和DAB酶底物顯色試劑盒（DAB-0031）均購自福州邁新生物技術公司。

1.2 方法 將組織芯片標簽向上并傾斜一定角度，置于60oC烤箱中3 h，融掉表面封蠟，經脫蠟、脫苯、水化后，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶15 min，0.1%枸櫞酸緩沖液（pH 6.0-6.2）中高溫高壓修復1.5 min，山羊血清37oC封閉20 min，滴加鼠抗人DNMT1一抗（1:200）或鼠抗人β-catenin一抗（1:200），4oC過夜后，依次加入生物素標記二抗和鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，分別于37oC下孵育30 min，DAB顯色后蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以組織芯片中癌旁正常肺組織作為內對照，以PBS取代一抗作為陰性對照。

結果判定：免疫組化染色后，組織芯片中組織形態結構較完好、能夠進行細胞染色陽性判定和計數的標本為有效病例。芯片中每一例組織標本直徑為1.0 mm，所以能夠在顯微鏡下觀察并計數每一例有效病例的瘤細胞總數和陽性瘤細胞數，得出每例標本DNMT1和β-catenin表達的陽性率，并計算出DNMT1在肺癌組織中的平均陽性率。刪除因掉片脫點而無法計數的病例。本研究中，DNMT1在肺癌組織中的平均陽性率為（58.04±35.07）%（n=84），所以將陽性率≥58%定為DNMT1高表達，陽性率＜58%或陰性定為DNMT1低表達。

1.3 統計學分析 運用SPSS 13.0進行數據分析，采用獨立樣本t檢驗分析DNMT1的表達在肺癌組織和癌旁正常肺組織間的差異；采用卡方檢驗、似然比法和Spearman等級相關分析DNMT1的表達與肺鱗癌和腺癌臨床病理因素的關系；采用Pearson相關分析DNMT與β-catenin表達的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DNMT1在肺鱗癌和腺癌中的表達顯著高于癌旁正常肺組織 DNMT1免疫組化染色后，詳細計數每一例肺癌和癌旁正常肺組織中DNMT1的陽性表達細胞數，并計算出陽性表達率。結果發現，84例癌旁正常肺組織中，有43例出現DNMT1在少數上皮細胞漿中的微弱表達，平均陽性表達率為（6.88±10.26）%（n=84），而在84例肺鱗癌和腺癌組織中，75例（89.29%）存在不同程度的DNMT1細胞漿（伴或不伴有細胞核）表達，平均陽性表達率為（58.04±35.07）%（n=84），顯著高于癌旁正常肺組織（t=12.835, P＜0.001）（圖1，表1）。

2.2 DNMT1的高表達與肺鱗癌和腺癌的分型、分化程度和淋巴結轉移相關 根據DNMT1高、低表達的判定標準，肺癌中有53例（63.10%）為DNMT1高表達，31例（36.90%）為DNMT1低表達。如表2所示，DNMT1在肺腺癌中的高表達率（37/47, 78.72%）顯著高于肺鱗癌（16/37, 43.24%）（P=0.001）；在中低分化肺癌中的高表達率（41/58, 70.69%）顯著高于高分化肺癌（12/26,46.15%）（P=0.021）；在有淋巴結轉移的病例中的高表達率（27/35, 77.14%）顯著高于無淋巴結轉移的病例（26/49, 53.06%）（P=0.024），而且DNMT1的表達在不同性別（P=0.018）、不同年齡段（P=0.023）的病例間也有統計學差異。但本研究未發現DNMT1的表達與腫瘤大小之間的關系（P=0.623）。進一步的Spearman等級相關分析也表明DNMT1的高表達與肺癌的組織學類型（r=0.365, P=0.001）、分化程度（r=0.253, P=0.021）、淋巴結轉移（r=0.246, P=0.024）、性別（r=0.262, P=0.017）和年齡（r=-0.253, P=0.022）相關。

圖 1 DNMT1和β-catenin在肺鱗癌、腺癌和癌旁正常肺組織中的表達（×400）。A：DNMT1在癌旁正常肺組織中陰性表達；B、C：DNMT1在肺鱗癌（B）和肺腺癌（C）中的細胞漿和細胞核表達；D： β-catenin在癌旁正常肺組織中的膜表達；E：β-catenin在肺鱗癌中的細胞漿和細胞核表達；F：β-catenin在肺腺癌中的細胞漿表達。Fig 1 The expressions of DNMT1 and β-catenin in lung squamous cell carcinoma, adenocarcinoma and corresponding normal lung tissues (×400).A: The negative expression of DNMT1 in corresponding normal lung tissue; B, C: The cytoplasmic-nuclear expression of DNMT1 in lung squamous cell carcinoma (B) and adenocarcinoma (C); D: The membranous expression of β-catenin in corresponding normal lung tissue; E: The cytoplasmicnuclear expression of β-catenin in lung squamous cell carcinoma; F: The cytoplasmic expression of β-catenin in lung adenocarcinoma.

表 1 DNMT1在肺癌和癌旁正常肺組織中的表達Tab 1 The expression of DNMT1 in lung cancer and corresponding normal lung tissues

2.3 DNMT1的表達與β-catenin的細胞漿表達相關 β-catenin免疫組化染色后，組織芯片中獲得有效病例77例。所有肺鱗癌和腺癌病例中均不同程度地出現了β-catenin的細胞漿表達，其平均表達率為（69.74±27.14）%，其中28例伴有不同程度的細胞膜表達（36.37%），7例伴有細胞核表達（9.09%）。β-catenin的細胞漿表達與肺癌的組織分型（r=0.301, P＜0.008）、腫瘤大小（r=0.204, P＜0.037）和淋巴結轉移（r=0.278, P＜0.014）相關，但未發現β-catenin細胞膜和細胞核表達與肺癌臨床病理因素的相關性，因已有大量關于β-catenin在肺癌中表達和意義的報道[5-7]，為避免重復，本研究對β-catenin與肺癌臨床病理因素的相關性不再贅述。經Pearson相關分析后發現DNMT1與β-catenin的細胞漿表達顯著相關（r=0.571, P＜0.001）（圖1），而與β-catenin的細胞膜（r=0.117, P=0.311）和細胞核表達（r=0.017, P=0.885）無明顯相關性。

表 2 DNMT1的表達與肺鱗癌和腺癌臨床病理因素的關系Tab 2 Relationships between DNMT1 expression and clinicopathologic characteristics of lung squamous carcinoma and adenocarcinoma

3 討論

肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，肺癌患者的死亡率在工業化國家中居惡性腫瘤之首[8]。抑癌基因的甲基化是肺癌發生和發展的重要原因之一，大量研究[1]表明肺癌中經常出現CDH1、p16、p53、PTEN、RB、APC[9]等多種抑癌基因的甲基化和失活。

DNA甲基轉移酶是調控CpG二核苷酸中胞嘧啶甲基化的關鍵分子，分為DNMT1、DNMT2和DNMT3三個亞家族，DNMT3又可分為DNMT3A和DNMT3B，它們不僅對維持染色體結構的穩定性、保障基因組表觀遺傳信息在親代細胞間的正確傳遞有重要作用，還與結腸癌[2]、乳腺癌[3]、胰腺癌[4]、肺癌[10]等多種惡性腫瘤中抑癌基因的甲基化、失活和腫瘤的發生發展、侵襲轉移有關。目前研究[1]表明DNMT1是在肺癌中起主要作用的DNA甲基轉移酶亞型。

為深入探討DNMT1與肺癌發生發展的關系，本研究首先檢測了DNMT1在肺癌和癌旁正常肺組織中表達的差異，結果發現，在84例癌旁正常肺組織中，只有約半數的肺組織（43例）中出現微量的DNMT1表達，平均表達率僅為（6.88±10.26）%，說明在正常肺組織中DNMT1處于低水平狀態，只有少數上皮細胞表達。而肺癌組織中，有89.29%的病例出現DNMT1不同程度的表達，平均表達率為（58.04±35.07）%，顯著高于癌旁正常肺組織（P＜0.001），說明DNMT1的高表達在肺癌中是普遍現象，這種大大超過正常水平的DNMT1的表達量，可能是導致大量抑癌基因甲基化、失活和肺癌形成、發展并侵襲轉移的重要原因之一。那么，DNMT1的高表達與肺癌發生發展和侵襲轉移的具體關系如何呢？為此，本研究詳細分析了DNMT1與肺癌臨床病理因素的關系，結果發現DNMT1的高表達與肺癌的組織學分型、分化程度和淋巴結轉移均有顯著的相關性，提示DNMT1的表達情況有可能為判斷腫瘤類型、惡性程度和預后提供重要的信息。與本研究結果相似，在結腸癌[2]、胰腺癌[4]、肝細胞癌[11]和粘液表皮樣癌[12]等腫瘤中均發現DNMT1的表達水平有明顯升高，并不同程度地與腫瘤的分化程度、臨床分期或（和）預后不良相關。Lin等[10]發現DNMT1在肺癌中的表達顯著，并與吸煙患者的預后不良相關，進一步的研究[13]表明吸煙將導致DNMT1降解失調并在細胞漿、核內蓄積，進而誘導抑癌基因甲基化和腫瘤的形成。本研究發現DNMT1的高表達與女性患者、肺腺癌相關，與此相似，Lin等[14]發現DNMT3b的高表達更常出現在腺癌組織和女性患者中，這可能與雌激素水平或腺癌病例中女性比例較高有關，其原因有待進一步研究證實。

β-catenin是Wnt通路的關鍵分子和重要的粘附分子，在正常上皮組織中定位于細胞膜，而在腫瘤中常出現異常的細胞漿和細胞核蓄積，并與Wnt通路的活化以及c-myc、Cyclin D1等靶基因的轉錄有關，以往的研究[5-7,15]表明β-catenin異常蓄積與肺癌的惡性表型和預后不良密切相關。本研究首次發現DNMT1與β-catenin的細胞漿表達呈顯著正相關，這表明它們二者之間存在著直接或間接的相互協同作用。有研究[9,16]表明，腫瘤中存在著Wnt通路負調控基因的甲基化，DNMT1可能通過Axin、APC等基因的甲基化，促進了β-catenin的失調控和蓄積，另外，β-catenin也可能通過多種靶基因產物直接或間接地促進DNMT1的表達，二者可能具有相互調控、相互協同，共同促進肺癌發生發展和侵襲轉移的作用。這一現象為深入研究肺癌中DNMT1與Wnt通路的調控機制開拓了新的方向。

綜上所述，DNMT1的高表達是肺鱗癌和腺癌的普遍現象；DNMT1的高表達與肺癌的腺癌組織學類型、低分化和淋巴結轉移相關；DNMT1與β-catenin的細胞漿表達呈顯著正相關。深入研究DNMT1在肺癌中的表達調控機制將有可能為肺癌的早期診斷和基因靶向治療提供新的線索和思路。