變性高效液相色譜法檢測多種途徑獲取的非小細胞肺癌組織表皮生長因子受體基因突變

陳思遠 陳志紅 郭愛林 蘇健 黃迎 陳世良 張緒超 楊學寧 楊衿記 吳一龍

作者單位：510080 廣州，廣東省醫(yī)學科學院，廣東省人民醫(yī)院，廣東省肺癌研究所（陳思遠，陳志紅，郭愛林，蘇健，黃迎，陳世良，張緒超，楊學寧，楊衿記，吳一龍） ；510515 廣州，南方醫(yī)科大學研究生學院（陳思遠）（通訊作者：吳一龍，E-mail: syylwu@live.cn）

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）酪氨酸激酶區(qū)（tyrosine kinase, TK）已成為目前研究進展最快、最受矚目的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）治療靶點，吉非替尼、厄洛替尼作為常見的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI），已廣泛應用于治療NSCLC晚期患者。眾多研究[1-4]表明，TKIs的療效與EGFR TK區(qū)是否存在突變以及突變類型有關，據(jù)此，在對晚期NSCLC患者進行治療決策前，明確其EGFR基因類型是非常必要的。

目前，DNA直接測序是檢測EGFR突變最常用的方法，同時也作為突變檢測的“金標準”，但該方法步驟繁瑣、耗時較長、費用較高、所需組織量較多且敏感度較低，并不能滿足臨床需求。而變性高效液相色譜（denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC）是一種新的高通量篩選基因序列變異的技術，其原理是利用離子對反向高效液相色譜法在部分變性的溫度條件下分離、識別野生型及突變型DNA雙鏈，具有快速、自動化、敏感性、特異性高等特點[5-7]。本研究比較了DHPLC和DNA直接測序法對由CT引導經(jīng)皮細針肺穿刺活檢、淋巴結(jié)活檢以及外科切除三種途徑獲取的83例NSCLC腫瘤組織EGFR基因外顯子19、21突變的檢測結(jié)果，進行DHPLC作為快速EGFR突變臨床診斷平臺的可行性分析，并分析了EGFR突變的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 研究對象及標本收集 隨機選取2008年1月-2009年6月廣東省人民醫(yī)院收治的83例NSCLC患者的腫瘤組織，其中CT引導經(jīng)皮細針肺穿刺活檢標本37份、淋巴結(jié)活檢標本15份以及外科切除標本31份。所有腫瘤標本離體后立即置入液氮中，后轉(zhuǎn)入-80oC低溫冰箱中保存。其中男性54例，女性29例；年齡32歲-76歲，平均年齡57.93歲；腺癌56例，鱗癌19例，其它類型8例；1999年TNM分期：I期18例、II期3例、III期24例、IV期38例。所有患者獲取標本前均未接受化療或靶向治療，相應組織經(jīng)病理確診后納入研究。

1.2 DNA提取 采用上海華舜生物有限公司小量組織細胞基因組DNA快速抽提純化試劑盒，應用組織勻漿法。經(jīng)Eppendorf核酸蛋白測定儀測定DNA純度及含量，要求光密度值OD280/OD260＞1. 80，調(diào)整DNA濃度至10 ng/μL。

1.3 PCR擴增 應用PCR擴增EGFR外顯子19、21的基因片段。引物使用Primer Premier 5軟件自行設計，由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序列如下：exon19：5'-ACTGTAAAACGACGGCCAGT-3'和3'-ACCAGGAAACAGCTATGACC-5'；exon21：5'-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3'和3'-CCTTACTTTGCCTCCTTCTGCAT-5'。反應體系：模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL， MarsterMix（Qiangene公司）12.5 μL，加三蒸水至總體系共25 μL。反應條件：變性95oC、4 min；94oC、30 s，58oC、30 s和72oC、45 s，循環(huán)30次；72oC延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增片段。PCR產(chǎn)物分別用作直接測序法及DHPLC法檢測。

1.4 DNA直接測序法 PCR產(chǎn)物按操作說明書切膠過柱純化（QIAGEN, 28704），純化后的PCR產(chǎn)物作為模板，使用BDT V3.1測序試劑盒（Applied Biosystems）按照說明書在ABI3100測序儀（Applied Biosystems）進行測序檢測。采用Chromas軟件分析測序圖譜，尋找EGFR基因外顯子19、21突變區(qū)域，突變DNA陽性結(jié)果再通過反向引物測序進行驗證。

1.5 DHPLC檢測 DHPLC檢測使用WAVE4500核酸片段分析系統(tǒng)（Transgenomic公司），色譜柱為DNA SepCartridge分離柱，流動相為不同濃度的乙腈與三乙基銨醋酸鹽（triethylamine acetate, TEAA）配制的洗脫液。PCR產(chǎn)物不作任何純化處理，直接用于DHPLC分析。本研究采用了非變性條件及部分變性條件兩種檢測模式。其中非變性條件下WAVE4500系統(tǒng)運行檢測溫度為50oC，依賴DNA分子量大小分辨不同的PCR產(chǎn)物；部分變性條件下，PCR產(chǎn)物經(jīng)95oC完全變性后逐漸冷卻使其復性，若存在雜合性突變可形成異源雙鏈，WAVE4500系統(tǒng)檢測溫度應用WAVEMAKER軟件包進行預測，并根據(jù)峰型變化調(diào)整并獲得最佳檢測溫度，外顯子19、外顯子21分別為60.1oC、63.2oC。分別使用本實驗室構建的EGFR野生型、突變型質(zhì)粒作陰性、陽性對照，超純水作空白對照。DHPLC檢測出現(xiàn)2個洗脫峰或肩峰者判別為突變型，僅出現(xiàn)1個洗脫峰者判別為野生型。

1.6 DHPLC檢測的敏感性分析

1.6.1 EGFR野生型、突變型質(zhì)粒的構建 采用TA克隆法分別構建EGFR基因外顯子19、外顯子21野生型克隆和突變型（del746-750、L858R）克隆：分別提取已知EGFR外顯子19突變類型為del746-750的NSCLC細胞系PC-9、EGFR外顯子21突變類型為L858R的細胞系H1975以及EGFR外顯子19、21均為野生型的細胞系A549的DNA為模板進行PCR，PCR產(chǎn)物采用凝膠回收試劑盒進行回收純化，純化產(chǎn)物與pGEM-T easy（Promega）載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞，37oC過夜培養(yǎng)，篩選出重組體，將重組體加至LB培養(yǎng)基，37oC搖床孵育過夜，提取質(zhì)粒，測序，驗證轉(zhuǎn)入序列的正確性。序列正確的質(zhì)粒-20oC冰箱中保存待用。

1.6.2 DHPLC檢測的敏感性分析 純合突變型和野生型質(zhì)粒的DNA濃度均調(diào)整至5 ng/μL，然后按1:1、1:5、1:10、1:20、1:50、1:100比例將二者混合，模擬臨床檢測中所遇到的腫瘤細胞含量不同的組織。所有不同比例的質(zhì)粒DNA均分別取1 μL作為模板進行PCR擴增后直接用于DHPLC檢測。外顯子19分別采用非變性條件及部分變性條件進行檢測，并進行比較；外顯子21分別采用部分變性條件進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。應用χ2檢驗比較EGFR突變與患者性別、吸煙狀態(tài)、病理類型的關系。應用兩獨立樣本t檢驗比較EGFR突變型與野生型患者之間年齡是否存在差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DHPLC檢測的敏感性 現(xiàn)文獻[8-12]報道EGFR外顯子19常用非變性條件檢測模式，但該模式僅能檢測缺失突變，不能檢測未知的點突變。本研究對EGFR外顯子19按不同比例混合的野生型、del746-750缺失突變型質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物分別進行非變性條件及部分變性條件兩種模式檢測并與直接測序結(jié)果對比。當del746-750質(zhì)粒、野生型質(zhì)粒以1:100比例混合，突變型質(zhì)粒均可被上述兩種模式顯著檢出，而直接測序法僅可檢測至1:10水平（圖1A）。EGFR外顯子21只能采用部分變性條件模式檢測，當L858R質(zhì)粒、野生型質(zhì)粒以1:100比例混合可被顯著檢出，而直接測序法僅可檢測至1:10水平（圖1B）。

2.2 NSCLC腫瘤組織EGFR突變檢測結(jié)果

2.2.1 直接測序法檢測結(jié)果 83例NSCLC腫瘤組織中檢出EGFR突變19例，突變率為22.89%。其中外顯子19缺失突變10例，共有3種基因型，delE746-A750、delL747-A749 ins P以及delL747-S752 ins S分別為6例、3例、1例。外顯子21點突變9例，均為L858R。未檢出其它類型突變。

2.2.2 DHPLC與直接測序法對比 DHPLC法可檢出22例EGFR突變，突變率為26.51%。其中3例直接測序法結(jié)果判讀為野生型（圖2），余19例EGFR突變及61例野生型均與直接測序法結(jié)果相符（圖3），未發(fā)現(xiàn)DHPLC檢測為野生型但直接測序為突變型的樣本以及外顯子19、外顯子21均存在突變的樣本。因為外顯子19各型缺失型突變所缺失的堿基對數(shù)量相近，DHPLC檢測峰型相似，難以區(qū)分不同類型的外顯子19的缺失突變。由上述結(jié)果可得，DHPLC法敏感性（sensitivity）為100.00%，特異性（specificity）為95.31%，且對CT引導經(jīng)皮細針肺穿刺活檢、淋巴結(jié)活檢以及外科切除三種常見手段所獲取的腫瘤樣本均具有較高的敏感度、特異度；而且陽性預測值（positive predictive value）、陰性預測值（negative predictive value）、假陽性率（false positive）、假陰性率（false negative）、診斷符合率（diagnostic accordance rate）等評價指標均達較佳水平（表1）。

表 1 DHPLC法檢測NSCLC組織EGFR突變診斷的評價Tab 1 Evaluation of DHPLC as a detection method for EGFR mutations in NSCLC specimens

圖 2 DHPLC與直接測序結(jié)果不符的檢測圖譜。箭頭示突變峰，星號示外顯子21 L858位點未見突變。Fig 2 Atlas of discordant results between DHPLC and direct sequencing. The arrows indicated the mutant peaks, the asterisk indicated no mutation in exon 21 site 858.

圖 3 DHPLC與直接測序結(jié)果相符的檢測圖譜，箭頭提示突變峰。Fig 3 Atlas of concordant results between DHPLC and direct sequencing. The arrows indicated the mutant peaks.

2.2.3 EGFR突變與NSCLC患者臨床特征的關系 本研究結(jié)果提示83例NSCLC患者EGFR突變率為22.89%，女性患者EGFR突變率（37.93%）高于男性患者（突變率14.81%，χ2=5.712，P=0.017），腺癌患者EGFR突變率（32.14%）高于非腺癌患者（突變率3.70%，χ2=8.347，P=0.004），差異均有統(tǒng)計學意義；符合女性、非吸煙、腺癌的NSCLC患者EGFR突變率達40.74%。但EGFR基因型與患者吸煙狀態(tài)、年齡等無關（P＞0.05）。

3 討論

NSCLC靶向治療最新的進展來自以無進展生存期（progression free survival, PFS）為主要研究終點的III期臨床研究IPASS（Iressa Pan-Asia Study），EGFR突變亞組吉非替尼的PFS、客觀有效率（objective response rate, ORR）明顯優(yōu)于泰素聯(lián)用卡鉑（HR=0.48, 95%CI: 0.36-0.64,P＜0.001; 71.2% vs 47.3%, P＜0.001），而EGFR野生型亞組泰素聯(lián)用卡鉑優(yōu)于吉非替尼（HR=2.85, 95%CI: 2.05-3.98,P＜0.001; 23.5% vs 1.1%, P=0.001）[13]，提示存在EGFR外顯子19、21突變的NSCLC患者接受一線TKIs治療，可獲得較一線化療更優(yōu)的PFS和總生存時間（overall survival,OS），且毒副作用明顯較低；但對于EGFR野生型的患者，則很難從TKIs治療中獲益。據(jù)此，2010 NCCN NSCLC臨床實踐指南已推薦將厄洛替尼用于一線治療存在EGFR敏感突變的NSCLC患者。自此，制定晚期NSCLC患者治療決策前應明確EGFR基因是否存在突變及突變類型，存在敏感突變者給予TKIs，野生型或未知基因型者給予化療。

目前，DNA直接測序是EGFR突變檢測的“金標準”，而且是最常用的方法。但該方法步驟繁瑣、耗時較長、費用較高、所需組織量較大且敏感度較低，需EGFR突變DNA含量占樣本總DNA的20%-30%以上才可被檢出。據(jù)此，有必要建立更簡便、快速 、價格低廉、敏感度更高且準確的EGFR突變檢測方法。DHPLC是近年來國內(nèi)外興起的一種用于分析核苷酸片段的優(yōu)秀技術平臺。該系統(tǒng)可在同一分析標準下實現(xiàn)以下三種模式的運行：非變性條件：依賴分子量大小的分離；部分變性條件：根據(jù)片段大小、序列和部分變性溫度的差異分離；完全變性條件：根據(jù)片段大小和序列的分離。其中部分變性條件適用于基因突變及SNP的檢測，也是本研究所選取的技術平臺。DHPLC具有快速、高通量、操作簡單、費用低廉等優(yōu)點，已廣泛應用于微衛(wèi)星不穩(wěn)定的檢測、嵌合體和低頻突變的檢測、SNP的檢測和基因甲基化分析等。

本研究發(fā)現(xiàn)，DHPLC具有很高的檢測敏感性，當del746-750、L858R質(zhì)粒DNA僅占總DNA含量1:100時均可被顯著檢出，該結(jié)果與多項研究[9,10]一致，證實DHPLC具較佳的重現(xiàn)性，可在不同的實驗室進行比較。對于EGFR外顯子19 DHPLC非變性條件以及部分變性條件兩種檢測模式均有相似的敏感性，檢測峰型均易于判讀。部分變性條件也適用于EGFR外顯子19的檢測，而且有利于發(fā)現(xiàn)未知突變。本研究同時應用DHPLC檢測了83例NSCLC腫瘤組織EGFR外顯子19、21的基因狀態(tài)，與“金標準”直接測序法比較敏感度為100%、特異度95.31%、假陽性率4.69%、假陰性率為0%。而DHPLC診斷EGFR為野生型或突變型與金標準符合的概率即陽性預測值及陰性預測值分別為86.36%、100.00%，診斷符合率為96.39%。同時本研究中腫瘤樣本分別來源于經(jīng)皮肺穿刺、淋巴結(jié)活檢以及外科手術切除三種臨床最常用的途徑，DHPLC均獲得與直接測序法高度一致的結(jié)果，顯示該方法對不同類型的標本均可有效地進行突變檢測。DHPLC作為EGFR突變檢測的初篩方法，與“金標準”具有高度的一致性，提示DHPLC對臨床實踐存在潛在的應用價值。

同時本研究結(jié)果提示83例NSCLC患者EGFR突變率為22.89%，女性、腺癌患者中EGFR突變率顯著高于男性、非腺癌患者，EGFR突變與吸煙狀態(tài)、年齡等臨床特征無顯著相關。

綜上所述，本研究使用DHPLC系統(tǒng)檢測了NSCLC EGFR外顯子19、21突變，初步證實了該系統(tǒng)可應用于晚期NSCLC患者進行治療決策前的EGFR基因狀態(tài)初篩，并具有較高的敏感度、特異度，同時適用于多種來源的NSCLC腫瘤組織，且較直接測序法檢測敏感度更高、更節(jié)約檢測時間及費用，值得臨床推廣應用。