RNA干擾ERCC1基因表達對肺腺癌細胞A549/DDP順鉑耐藥的影響

高赟 蘇丹 應莉莎 呂汪霞 馬勝林

作者單位：310022 杭州，浙江省腫瘤醫院腫瘤研究所（高赟，蘇丹，應莉莎）；310022 杭州，浙江省腫瘤醫院腫瘤內科（呂汪霞，馬勝林）（通訊作者：馬勝林， ，E-mail : mashenglin@medmail. com. cn）

肺癌目前的發病率和死亡率在我國男性中均較高，約65%的肺癌患者確診時已屬晚期，失去了手術機會。化療在肺癌的綜合治療中占有重要地位，但多藥耐藥是影響其療效的主要障礙。越來越多的研究[1-3]表明，切除修復交叉互補基因 1 （excision repair cross complementing gene 1, ERCC1）表達水平與腫瘤順鉑 （cisplatin, DDP）耐藥以及肺癌患者生存時間相關。RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術是近年來較為熱門的一種研究基因功能和進行基因治療的新方法。本研究擬通過RNA干擾技術降低ERCC1基因的表達，探討干擾前后人肺癌耐順鉑細胞株A549/DDP對順鉑的敏感性變化，為克服肺癌順鉑耐藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肺癌耐順鉑細胞株A549/DDP由同濟大學上海肺科醫院周彩存教授惠贈，在含15%小牛血清的RPMI-1640培養基中培養，培養條件為37oC、5%CO2。

1.1.2 試劑與儀器 siRNA由Ambion公司設計合成；陽離子脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000、Trizol購于Invitrogen公司；反轉錄試劑購于Promega公司，熒光PCR試劑購于Bioer公司，其它試劑均為進口分裝或國產分析純。7700熒光定量PCR儀為ABI公司產品；多功能酶標儀為thermo公司產品。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設計、合成 由Ambion公司完成。

1.2.2 轉染 采用Lipofectamine 2000脂質體轉染法。當A549/DDP細胞融合30%-50%（此時細胞處于對數生長期，狀態最佳）在6孔板中進行轉染實驗。轉染步驟按說明書操作。

1.2.3 RT-PCR檢測RNAi后A549/DDP細胞ERCC1基因和GAPDH基因的表達 轉染48 h后每組分別收集細胞，提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA。以GAPDH為內參照擴增ERCC1基因。擴增條件為：95oC預變性10 min，95oC變性15 s，60oC退火45 s，72oC延伸45 s，40個循環后72oC延伸10 min。PCR產物作溶解曲線分析是否為引物二聚體。根據Ct值進行相對定量分析，各組ERCC1 mRNA相對表達量以相對于未轉染組的倍數2-ΔΔCt表示，ΔCt=CtERCC1-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtRNAi組-ΔCt脂質體組，抑制效率=1-2-ΔΔCt。

1.2.4 Western blot檢測RNAi前后A549/DDP細胞ERCC1蛋白表達水平變化 收集對數生長期A549和A549/DDP細胞，用1 mL 1×PBS收集下來后在4oC、2 000 rpm轉速下離心5 min，棄去上清。加入適量的含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液。在冰上用細胞超聲粉碎儀進行超聲裂解直至細胞液變成澄清透明，4oC、13 000 rpm轉速下離心30 min。將上清轉移至新管，用5×SDS電泳樣品緩沖液在沸水中煮沸5 min變性，-20oC保存備用。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測收集的蛋白濃度，蛋白上樣量為30 μg每孔，依次進行電泳及轉膜、封閉及抗體孵育、顯影。Bio-Rad公司Quantity One軟件分析轉染組與對照組蛋白表達強度。

1.2.5 MTT法檢測RNAi后A549/DDP細胞對順鉑敏感性的變化 取對數生長期的A549/DDP細胞，以4×103/孔接種于96孔板上，24 h后換成無血清1640培養液，48 h后按說明書操作進行轉染。轉染8 h后加入不同濃度順鉑（終濃度分別為32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL）繼續培養48 h。每孔加入5 mg/mL四甲基偶氮唑藍（MTT）20 μL，4 h后加DMSO震蕩10 min，酶標儀測定570 nm處的吸光度，計算半數抑制量（IC50）值。

1.3 統計學處理 統計使用SPSS 12.0統計軟件，數據以Mean±SD表示，統計學分析采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNAi后A549/DDP細胞ERCC1基因的表達變化 根據2-ΔΔCt值的大小，得到三組細胞ERCC1基因表達的相對差異（圖1）。與脂質體組相比，RNA干擾組細胞ERCC1基因表達降低，其中針對ERCC1基因第346核苷酸設計的siRNA（RNAi 1組）干擾效率要高于針對第281核苷酸設計的siRNA（RNAi 2組）。

2.2 RNAi后A549/DDP細胞ERCC1蛋白表達水平改變 轉染前，A549/DDP細胞中ERCC1蛋白相對表達強度為0.710±0.057，轉染ERCC1 siRNA后降為0.495±0.102，ERCC1蛋白表達明顯降低（P＜0.05）（圖2）。

2.3 RNAi后A549/DDP細胞對順鉑敏感性的變化 轉染ERCC1 siRNA后，RNAi組A549/DDP細胞對順鉑的IC50值為9.27 μg/mL，對照組細胞的IC50值為12.49 μg/mL，轉染后細胞對順鉑的敏感性增加了1.35倍。RNAi組和對照組細胞的抑制率見圖3。

表1 針對靶基因ERCC1 mRNA設計2對siRNA序列Tab 1 Two pairs of ERCC1 siRNAsequences designed according to target gene ERCC1 mRNA

圖 1 不同siRNA對ERCC1基因表達的抑制效率Fig 1 The inhibition rates of two siRNAs on the expression of ERCC1 gene. *: P＜0.05, vs control.

圖 2 A549/DDP轉染ERCC1 siRNA前后ERCC1蛋白表達水平的變化Fig 2 ERCC1 protein expression levels of A549/DDP before and after transfection with siRNA ERCC1

圖 3 不同濃度順鉑對RNA干擾后A549/DDP細胞的抑制率Fig 3 The effect of cisplatin on A549/DDP cell proliferation transfected by siRNA. *P＜0.05, vs control.

3 討論

化療在肺癌的治療中占有重要地位，單藥化療中最有效的是DDP，目前最常以DDP為基礎組成聯合方案。耐藥是影響化療療效和肺癌患者生存率的主要原因。目前研究[4-7]認為順鉑耐藥機制主要包括：藥物外排增加、耐藥相關基因的改變、DNA損傷修復功能增強、細胞凋亡受抑制等。其中，DNA損傷修復功能是肺癌順鉑耐藥機制研究及肺癌個體化治療的熱點。DNA修復主要存在5種途徑：核苷酸切除修復（nucleotide excision repair,NER）、錯配修復、堿基切除修復、同源NER重組修復和非同源末端連接。其中NER可切除修復各種結構不相關的DNA損傷，特別是在龐大的DNA共價損傷的修復中發揮重要作用，比如紫外線照射誘發的嘧啶二聚體、多環芳香碳氫化合物、氧化損傷以及鉑類藥物所致的DNA損傷。ERCC1、ERCC2、ERCC3等20多種蛋白參與其中，而DNA損傷的識別/切除是限速步驟，使得在該步驟中起主導作用的ERCC1最為引人矚目，其功能活性的高低可反映整個NER修復活性的水平[8]。

目前，有效抑制基因表達的方法主要有：基因敲除[9]、反義核苷酸技術[10]和RNAi技術[11,12]。其中，RNAi技術比基因敲除技術易于操作，而且基因抑制效果好于反義核苷酸技術。將與mRNA序列對應的正義和反義RNA組成的雙鏈RNA導入細胞，可以使RNA降解和基因沉默，這種轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）被稱為RNAi[13,14]。siRNA的設計是RNAi技術成敗的關鍵。根據siRNA的設計原則，本實驗設計合成2對siRNA序列。通過篩選，我們認為針對ERCC1基因346核苷酸設計的siRNA能更有效地抑制該基因表達，抑制效率更高。RT-PCR和Western blot結果均證明，轉染ERCC1 siRNA后，與對照組相比人肺腺癌細胞株A549/DDP細胞ERCC1基因和蛋白表達水平明顯降低，表明通過RNAi后ERCC1基因的轉錄和翻譯均被抑制。

A549/DDP細胞是用小劑量DDP作為誘導劑、對人肺腺癌細胞A549進行逐步長期誘導而建立的耐DDP人肺腺癌細胞株。MTT實驗結果顯示在一定的劑量范圍內，隨著DDP濃度的升高，順鉑對RNAi后A549/DDP細胞的抑制率增加，研究證實降低ERCC1基因表達水平可以提高鉑類藥物化療敏感性，ERCC1可以作為肺癌個體化治療時是否選擇順鉑的預測指標之一。應用siRNA干擾技術誘導ERCC1基因表達下調，可增加肺癌細胞等腫瘤對鉑類藥物的敏感性，具有一定的臨床潛在應用價值，為今后非小細胞肺癌的個體化治療提供了一定的理論依據。實驗發現當DDP濃度達到一定的劑量后抑制率反而降低，我們認為RNAi技術對ERCC1基因的不完全抑制及其它耐藥機制的存在導致了A549/DDP細胞耐藥逆轉的不徹底性。另外，腫瘤耐藥不是單基因作用的結果，還有其它因素的參與，封閉單個基因不能完全逆轉耐藥。因此，ERCC1 siRNA可作為治療肺癌耐藥的新策略，但是其逆轉耐藥的不徹底性仍是需要克服的主要問題，使用多基因多靶點siRNA可能是一種可行的選擇。