蟾蜍靈對人非小細胞肺癌A549細胞增殖與凋亡的影響

朱志圖 郁云龍 王鍇 李恩澤 劉陽陽 劉云鵬

作者單位：121001 錦州，遼寧醫學院附屬第一醫院腫瘤科（朱志圖，郁云龍，王鍇，李恩澤，劉陽陽）；110001 沈陽，中國醫科大學附屬一院腫瘤內科（劉云鵬）（通訊作者：郁云龍，E-mail:yunlong615@163.com）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌總數的80%-85%，而其中近1/3的患者初次確診時已為局部晚期[1]，多數NSCLC患者可能在其病程的不同時期需要接受藥物化療。常用抗腫瘤藥物的臨床療效有限，且抗瘤藥物的諸多毒副作用如骨髓抑制、消化道反應等會嚴重影響腫瘤患者對化療的耐受性和依從性。因此，尋找高效低毒的治療藥物成為近年來腫瘤基礎和臨床研究的熱點。蟾蜍靈（Bufalin）是從中藥蟾酥中提取出來的有效成分之一，體外實驗和部分動物實驗[2,3]發現，蟾蜍靈可以選擇性地誘導一系列不同來源的腫瘤細胞凋亡，但對正常宿主細胞無明顯殺傷作用。在本實驗中，我們研究了蟾蜍靈對NSCLC細胞株A549的誘導凋亡作用及其可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 蟾蜍靈、碘化丙錠（propidium iodide,PI）、核糖核酸酶（ribonucleic acid enzyme, RNAse）、F12K培養基購于Sigma公司；胎牛血清購于中國醫學科學院血液學研究所；兔抗人Caspase-3、β-actin抗體購于Santa Cruz公司；兔抗人Livin抗體購于博士德生物工程有限公司；羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）購于北京華美公司。將蟾蜍靈用無水乙醇配制成10 mmol/L的儲存液，-20oC貯存。實驗前用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline, PBS）稀釋，將乙醇終濃度控制在體積分數＜0.01%。預實驗表明，該濃度乙醇對細胞增殖無影響。

1.2 細胞培養 人肺腺癌細胞株A549購于中科院上海細胞庫，置于含10%胎牛血清的F12K培養液中，37oC、5%CO2、飽和濕度的培養箱內傳代培養，0.25%胰酶消化液消化傳代，3天-4天傳代1次。所有實驗均采用對數生長期細胞。

1.3 MTT法進行細胞活力檢測 取對數生長期細胞，常規胰酶消化制成單細胞懸液，將細胞濃度調至2×104/mL-10×104/mL接種于96孔板，每孔180 μL，培養過夜后分別加入終濃度為10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L的蟾蜍靈，空白組和對照組加入等量的培養液，每組設3個復孔，每孔終體積為200 μL。加藥分別培養48 h、72 h和96 h，終止培養前4 h每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，到預定時間后吸去上清，每孔加入200 μL DMSO，振蕩搖勻。用酶標儀于570 nm波長條件下測定吸光度。按下列公式計算細胞增殖抑制率: 增殖抑制率（%）=1-（處理組平均OD值-空白對照組平均OD值）/（對照組平均OD值-空白對照組平均OD值）×100%。計算蟾蜍靈抑制細胞增殖50%的藥物濃度（IC50），并繪制細胞增殖抑制曲線。

1.4 瑞氏-吉姆薩染色法觀察細胞形態變化 40 nmol/L蟾蜍靈作用細胞48 h后分別收集對照組及處理組細胞，2 000 r/min離心機甩片3 min制成細胞涂片，用瑞氏-吉姆薩染液染色，光學顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期分布及凋亡情況 用20 nmol/L、40 nmol/L、100 nmol/L蟾蜍靈分別作用細胞48 h、72 h，胰酶消化后收集細胞1 000 r/min離心5 min，冷PBS洗滌，加入70%的冷乙醇4oC過夜，PBS再次離心洗滌，加入RNAse（10 μg/mL）37oC孵育30 min后，加入終濃度為10 μg/mL的PI，避光反應30 min后使用流式細胞儀進行DNA含量測定，采用Cell Quest軟件進行細胞各周期的百分比分析，同時判定凋亡細胞百分率。

1.6 Western blot方法檢測Livin、Caspase-3蛋白表達水平 將對照組和蟾蜍靈作用后的細胞裂解于RIPA裂解液中，冰上裂解40 min后，12 000 r/min離心20 min，取上清，采用Lowry法進行蛋白定量。與3×樣品緩沖液混合后煮沸5 min。將蛋白樣品（50 μg/lane）在15%的SDS-聚丙烯凝膠中電泳約3 h，然后轉印至硝酸纖維素膜上90 min。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，按預染Marker標記的分子量剪裁轉印膜，分別加入Livin抗體（1:300）、Caspase-3（1:1 000）抗體及β-actin抗體（1:1 000），過夜。TTBS洗4次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1:800）作用30 min，ECL法顯色后GIS凝膠圖像分析系統拍照并分析處理。

1.7 統計學處理 所有數據均為3次獨立實驗結果，以Mean±SD表示，采用SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蟾蜍靈明顯抑制A549細胞增殖 10 nmol/L-200 nmol/L蟾蜍靈分別作用A549細胞48 h、72 h及96 h，MTT結果顯示，蟾蜍靈抑制細胞增殖呈時間、劑量依賴關系。48 h、72 h及96 h的IC50值分別為（56.14±6.72）nmol/L、（15.57±4.28）nmol/L及（7.39±4.16）nmol/L（圖1）。

2.2 蟾蜍靈作用A549細胞后的形態學變化 用40 nmol/L蟾蜍靈作用A549細胞48 h后，瑞氏-吉姆薩染色，光鏡下可以觀察到細胞染色質固縮、胞核碎裂及凋亡小體形成等典型的凋亡細胞形態（圖2）。

2.3 蟾蜍靈誘導A549細胞凋亡 20 nmol/L、40 nmol/L、100 nmol/L蟾蜍靈分別作用細胞48 h及72 h后，流式細胞儀檢測顯示形成明顯的亞二倍體凋亡峰（sub-G1峰），亞二倍體細胞百分數（細胞凋亡率）48 h分別為（2.93±0.67）%、（4.86±1.26）%及（7.34±1.85）%；72 h分別為（4.64±0.74）%、（9.86±1.63）%及（18.05±1.58）%，與對照組比較差異有統計學意義（均P＜0.01）（圖3）， 其余細胞周期分布無明顯變化。

圖 1 細胞增殖抑制曲線Fig 1 The curve of cell proliferation inhibition

圖 2 蟾蜍靈對A549細胞形態學的影響（瑞氏-吉姆薩染色，×400）。A：對照組；B：40 nmol/L。Fig 2 The effect of Bufalin on A549 cell morphology(Wright-Giemsa, ×400). A: Control; B: 40 nmol/L.

2.4 蟾蜍靈對Livin蛋白表達的影響 用20 nmol/L、40 nmol/L、100 nmol/L蟾蜍靈分別作用細胞48 h，Western blot檢測結果顯示，Livin蛋白表達分別下調至作用前的（61.29±7.76）%、（29.03±4.63）%及（22.17±6.02）%，與對照組比較其差異具有統計學意義（均P＜0.01）（圖4）。

2.5 蟾蜍靈對Caspase-3蛋白活化的影響 Western blot結果顯示，20 nmol/L蟾蜍靈作用細胞48 h僅檢測到非活化狀態32 kDa的Pro-Caspase-3，而40 nmol/L、100 nmol/L可檢測到Caspase-3的活化亞基（17 kDa），且隨濃度增大活化程度更明顯（圖5）。

3 討論

蟾蜍靈是中藥蟾酥的有效成分之一，國內外學者的研究報道，蟾蜍靈可以誘導部分白血病細胞及實體瘤細胞分化及凋亡。Amano等[4]研究表明蟾蜍靈可以通過增加維生素D3受體而增強1,25(OH)2D3誘導髓樣白血病細胞分化的能力，為進一步明確蟾蜍靈誘導白血病細胞分化提供了理論依據；Chen等[5]也通過基因表達圖譜驗證了蟾蜍靈誘導HL-60細胞凋亡過程中異常活化NF-kB及AP-1基因，但蟾蜍靈誘導細胞凋亡的確切機理尚未闡明，目前研究認為其作用機理與survivin、c-myc、WT1、AP-1等基因及MAPK信號通路調節相關。本研究結果顯示蟾蜍靈可以時間、劑量依賴的方式抑制肺癌A549細胞增殖，同時誘導其凋亡。實驗研究表明許多抗癌藥物作用于腫瘤細胞，在低蟾蜍靈濃度、短時間時表現為周期阻滯，高濃度、長時間表現為凋亡。但目前關于蟾蜍靈引起細胞周期阻滯的報道不一，Li等[6]報道20 nmol/L蟾蜍靈作用胃癌MGC803細胞24 h后可引起明顯的G2/M期阻滯；但Nasu等[7]報道蟾蜍靈引起子宮內膜異位基質細胞G0/G1期阻滯。在本研究中，流式細胞儀分析顯示并未觀察到明顯的細胞周期阻滯，而是出現明顯的亞二倍體凋亡峰，且經瑞氏-吉姆薩染色后亦可觀察到處理組細胞染色質固縮、胞核碎裂及凋亡小體形成等典型的凋亡細胞形態。這些結果提示蟾蜍靈作用于不同的細胞系可能引起不同的細胞周期分布，其對細胞周期阻滯的影響可能存在細胞特異性。

圖 3 流式細胞儀檢測蟾蜍靈誘導的凋亡細胞。A：不同濃度蟾蜍靈培養A549細胞48 h及72 h；1：對照組（48 h）；2：20 nmol/L（48 h）；3：40 nmol/L（48 h）；4：100 nmol/L（48 h）；5：對照組（72 h）；6：20 nmol/L（72 h）；7：40 nmol/L（72 h）；8：100 nmol/L（72h）；B：蟾蜍靈誘導細胞凋亡（*：P＜0.01，與對照組比較）。Fig 3 Analysis of apoptosis induced by Bufalin in A549 cells by flow cytometry. A: A549 cells were cultured 48 h and 72 h with different concentrations;1: Control (48 h); 2: 20 nmol/L (48 h); 3: 40 nmol/L (48 h); 4: 100 nmol/L (48 h); 5: Control (72 h); 6: 20 nmol/L (72 h); 7: 40 nmol/L (72 h); 8: 100 nmol/L(72 h); B: Bufalin induces A549 cells apoptosis (Compared with control group,*: P＜0.01).

圖 4 蟾蜍靈對Livin蛋白表達的影響。1：對照組；2：20 nmol/L；3：40 nmol/L；4：100 nmol/L。Fig 4 The expressions of Livin protein after treatment with Bufalin. 1:Control; 2: 20 nmol/L; 3: 40 nmol/L; 4: 100 nmol/L.

圖 5 蟾蜍靈對Caspase-3蛋白活化的影響。1：對照組；2：20 nmol/L；3：40 nmol/L；4：100 nmol/L。Fig 5 The expressions of Caspase-3 protein after treatment with Bufalin. 1: Control; 2: 20 nmol/L; 3: 40 nmol/L; 4: 100 nmol/L.

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族是機體內抗凋亡因子之一，在腫瘤的形成過程中發揮著重要作用。Livin作為IAP家族的新成員，近年來研究表明，Livin的過度表達預示著腫瘤惡性度高、生存期短和預后不良，并可能是導致腫瘤細胞耐藥的因素之一。在本實驗中，蟾蜍靈誘導A549細胞凋亡過程中Livin蛋白的表達明顯下調，相對應A549細胞的凋亡率隨之上升。目前的許多研究[8,9]已經通過把Livin作為靶點，在分子水平上抑制其表達而誘導腫瘤細胞凋亡并提高腫瘤細胞對促凋亡刺激的敏感性。

Caspases是一組天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡過程中起關鍵作用。Caspase-3是細胞凋亡的核心酶，被認為是細胞凋亡的中心環節和執行者。許多凋亡誘導劑可通過Caspase-3依賴的方式誘導腫瘤細胞凋亡。本實驗結果顯示，40 nmol/L、100 nmol/L蟾蜍靈作用A549細胞48 h可檢測到Caspase-3（17 kDa）活化亞基，首次證實蟾蜍靈在誘導A549細胞凋亡過程中裂解活化Caspase-3，提示蟾蜍靈可通過Caspase-3依賴的方式誘導細胞凋亡。

目前研究[10]認為Livin主要是在蛋白水平通過BIR結構域與介導細胞凋亡的下游效應Caspases，即激活形式的Caspase-3和Caspase-7結合后抑制細胞凋亡。在Fas/Caspase-8誘導的死亡受體途徑中，Livin直接抑制該途徑中的核心酶Caspase-3發揮作用；而在另一條由細胞色素C（cytochrome c, Cyt-c）/凋亡蛋白活化因子1（apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1）作用的線粒體途徑中，Livin也能與Caspase-9的前體蛋白及其激活形式結合或通過阻斷Caspase-3對Caspase-9前體蛋白的反饋激活從而產生抗凋亡的作用。在本實驗中，蟾蜍靈作用A549細胞48 h后，隨著藥物濃度的增加，Livin蛋白的表達分別下調，而同時亦檢測到Caspase-3蛋白的逐漸活化。由此可推測，蟾蜍靈作用肺癌A549細胞后，通過下調凋亡抑制蛋白Livin的表達，解除了IAP對Caspase-3的抑制，使Caspase-3蛋白裂解活化，即有活性的凋亡效應蛋白Caspase-3（17 kDa）表達上調，凋亡率隨之增加，這同Livin具有抗凋亡作用的理論也是相吻合的。以上實驗結果表明，一定濃度的蟾蜍靈在體外對人非小細胞肺癌A549細胞有顯著的生長抑制作用，下調凋亡抑制蛋白Livin及活化Caspase-3是其誘導細胞凋亡機制之一，上述結果為蟾蜍靈進一步的實驗研究提供了一定的理論依據，但其誘導細胞凋亡的確切機制有待今后進一步的研究來不斷完善。