超聲波對麥胚蛋白性質及其酶解物ACE抑制活性的影響

趙偉睿, 馬海樂＊,2,3, 賈俊強, 李云亮, 楊會麗

(1.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013;2.河南科技大學食品與生物工程學院,河南洛陽 471039;3.江蘇省農產品生物加工與分離工程技術研究中心,江蘇鎮江 212013)

超聲波對麥胚蛋白性質及其酶解物ACE抑制活性的影響

趙偉睿1, 馬海樂＊1,2,3, 賈俊強1, 李云亮1, 楊會麗1

(1.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013;2.河南科技大學食品與生物工程學院,河南洛陽 471039;3.江蘇省農產品生物加工與分離工程技術研究中心,江蘇鎮江 212013)

為了提高麥胚分離蛋白酶解產物的降血壓活性,采用超聲波處理麥胚分離蛋白。研究了超聲波功率對麥胚分離蛋白的溶解度、表面疏水性、熒光光譜、巰基含量變化、水解度和酶解產物對血管緊張素轉換酶(ACE)相對抑制活性的影響。結果表明:經超聲波處理后,小麥胚芽球蛋白的熒光光譜和巰基含量均發生了顯著的變化。麥胚分離蛋白的溶解度和表面疏水殘基含量隨著超聲波功率的增加而提高,但當超聲功率達到800 W后,增幅趨于平緩。經超聲波前處理后,ACE抑制活性明顯提高,而麥胚分離蛋白的酶解產物水解度沒有明顯變化,因此ACE抑制活性的提高是由于蛋白結構的變化造成的。在超聲功率800 W時,酶解產物的ACE相對抑制活性提高了41.09%。

超聲波處理;麥胚蛋白;結構;ACE抑制活性;酶解

在食品的加工與消化過程中,蛋白質通過蛋白酶的作用會釋放出血管緊張素轉換酶(ACE)抑制肽,它通過抑制血管緊張素轉換酶活性,阻礙有升高血壓作用的血管緊張素Ⅱ的生成,同時抑制具有降血壓作用的血管舒緩激肽的分解,從而起到降血壓作用[1]。由于食物源ACE抑制肽因其安全性高,副作用小,易吸收等特點,使酶解蛋白質制備ACE抑制肽成為了生物活性肽研究的熱點[2-3]。

通過物理場作用可以使蛋白質結構發生改變,使蛋白質的結構發生改變,從而改變蛋白質的加工性能,降解性能以及暴露[4]。超聲波作為一種物理強化手段,可在瞬間產生高溫和幾千個大氣壓的高壓,并伴有強大的沖擊波或射流[7]。因此,超聲波會使媒質的狀態、組成、結構和功能等發生變化。本研究通過超聲前處理麥胚分離蛋白,在研究超聲波處理對小麥胚芽分離蛋白結構的影響的基礎上,研究了超聲波前處理麥胚蛋白對制備麥胚蛋白降血壓肽活性的影響,為超聲波強化制備小麥胚芽分離蛋白降血壓肽提供了一定的理論和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂小麥胚芽:河南漫天雪面粉廠產品;中溫淀粉酶480L(527.50KNU/g):Novo公司;Alcalase2.4LFG蛋白酶(2.670AU/g):Novo公司產品;血管緊張素轉換酶(ACE)、1–苯胺基–8–萘磺酸鹽(ANS)、5,5’–二硫代–2–硝基苯甲酸(DTNB),Sigma公司產品;N-(3[2-Furyl]Acryloyl)-Phe-Gly-Gly(FAPGG),Fluka公司產品;其余試劑均屬國產分析純。

1.2 儀器

WFJ 7200型可見分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司產品;HH-6數顯恒溫水浴鍋:江蘇金壇市富華儀器有限公司產品;酶標儀:Thermo公司生產。GA99-ⅡD超聲細胞粉碎機:(該設備超聲的頻率為20kHz),無錫上佳生物科技公司產品; Avanti J–25高速冷凍離心機:美國Beckman公司生產;Cary Eclipse熒光分光光度計:美國Varian公司生產。

1.3 方法

1.3.1 麥胚分離蛋白的提取 采用文獻[8]的a-淀粉酶法提取麥胚分離蛋白(DWGP),略有改動。將脫脂后小麥胚芽用粉碎機粉碎后過100目篩,將脫脂小麥胚芽粉按照質量分數為10%加入蒸餾水中,按1 g/dL加入NaCl,攪拌30 min,用1mol/L的NaOH溶液調制p H值9.0下攪拌30 min,5 000 r/ min離心20 min,獲得上清液用1mol/L的HCl溶液調節p H值到6.5,采用中溫淀粉酶在70℃下酶解180 min,加酶量為3 g/dL;酶法降解淀粉后,調節p H到4,得到沉淀,用水溶解,調節p H值至7.0,噴霧干燥。

1.3.2 麥胚分離蛋白的超聲處理 配置1 g/dL的麥胚蛋白溶液,并控制樣品溶液初始溫度在15℃。分別用80 mL的麥胚蛋白溶液在不同超聲功率處理20 min。對處理后的樣品分別進行理化性質和功能性質分析。

1.3.3 麥胚分離蛋白的酶解 將處理與未處理的麥胚蛋白溶液在50℃水浴中平衡至50℃,加入20 μL Alcalase2.4LFG蛋白酶,在p H為9.0的條件下酶解60 min,在沸水域中滅酶10 min,冷卻到室溫。12 000 r/min離心10 min,移取全部上清,定溶至100 mL。

1.3.4 肽液濃度的測定方法 肽液濃度測定采用福林酚法[9]。

1.3.5 麥胚分離蛋白溶解度的測定 溶解性是蛋白質的最基本的物理性質,是影響蛋白質深度加工與應用的重要指標。將超聲處理前后的麥胚分離蛋白溶液在轉速10 000 r/min下離心10 min,用Folin–酚法測定上清液中蛋白含量[10],以可溶性蛋白含量表示溶解度的變化。

1.3.6 麥胚分離蛋白的表面疏水性的測定 表面疏水性采用Kato and Nakai的ANS熒光測定法[11],熒光強度與蛋白的表面疏水殘基含量成正相關。測定方法:將超聲波處理與未處理的蛋白樣品用0.1 mol/L的磷酸氫二鈉–磷酸二氫鈉(p H7.0)緩沖液稀釋到0.50 mg/mL,取稀釋樣品4 mL,加入20μL 1–苯胺基–8–萘磺酸鹽(ANS)溶液(0.01 mol/L),在激發波長為390 nm(狹縫寬度為5nm),發射波長為400～650nm(狹縫寬度為10 nm)測其熒光值,掃描速度為5nm/s。

1.3.7 熒光光譜掃描 將超聲波處理與未處理的蛋白樣品用0.1 mol/L的磷酸氫二鈉–磷酸二氫鈉(p H7.0)緩沖液稀釋到0.50 mg/mL分別用熒光分光光度計掃描,掃描條件為激發波長280 nm,發射波長400～800 nm,激發縫寬為2.5 nm,發射縫寬為5 nm。同時用未經超聲波處理的蛋白樣品作對照。

1.3.8 麥胚分離蛋白游離巰基含量的測定 游離巰基(SHF)含量采用Beveridge,Toma,and Nakai (1974).的測定方法[12],略有改動:取1 g/dL的麥胚蛋白溶液樣品2 mL,加入到6 mL含有8 mol/L尿素的p H 8.0的Tris–Gly緩沖液(0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L glycine、0.004 mol/L EDTA)中,攪拌溶解1h,10 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液加入80μL Ellman’s試劑,立即混勻,5 min后測定412 nm吸光度。以不加樣品,而加Ellman’s試劑為空白。

以Ellman’s試劑–SH的摩爾吸光系數為1.36×104計算游離巰基(SHF)的含量,SHF的計算公式如下:

式中 A412為412nm吸光度;c為樣品蛋白質(mg/ mL).D為稀釋倍數。

1.3.9 水解度(DH)測定方法 水解度定義為產物中非蛋白氮含量與反應底物蛋白質質量的比值[13]。非蛋白氮是通過在反應樣品中加入6 g/dL的三氯乙酸,震蕩5min,12 000 r/min離心10min制備,用福林酚法測定其濃度。底物蛋白質含量由微量凱式定氮法測定。

1.3.10 ACE抑制活性的測定 采用FAPGG作為ACE的底物[14-15],按表1添加各反應組分,用酶標儀測定樣品的ACE抑制活性。測定波長為340 nm。設空白孔的初始吸光度為a1,樣品孔的初始吸光度為b2,在37℃的環境中反應30 min后再次測定在340 nm的吸光度,反應后空白孔的吸光度為a2,樣品孔的吸光度為b2,空白的吸光度減少值A=a1-a2,樣品的吸光度減少B=b1-b2,抑制率I=(A-B)/A。樣品相應抑制率的質量濃度為c(mg/ mL),樣品的相對抑制活性為W=I/C,單位為mL/mg。

表1 ACE抑制活性的測定Tab.1 Determination of the ACE inhibition activity

2 結果與討論

2.1 超聲處理對麥胚分離蛋白溶解度的影響

溶解度是蛋白質物化性質的指標之一,并且和蛋白質的起泡性,凝膠性和乳化性相關[16]。不同超聲功率對麥胚分離蛋白溶解度的變化如圖1所示。

圖1 不同超聲功率對麥胚分離蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of ultrasound power on the isolated soy protein solubility

由圖1結果表明,超聲處理可顯著提高蛋白質的溶解度。當超聲波功率低于800 W時,隨著超聲波功率的增加,小麥胚芽蛋白的溶解度迅速增加;超聲波功率大于800 W時,小麥胚芽蛋白的溶解度增幅變緩。分析原因可能是:首先超聲產生的空化效應和機械效應打開蛋白聚集體同時打斷了蛋白質分子的四級結構,釋放出小分子的亞基,蛋白分子部分展開,形成溶于水的非共價鍵分子,與溶劑水的相互作用力加強,使其溶解度增加[17],說明麥胚分離蛋白質的結構在經超聲處理后放生了改變。但隨著超聲處理功率增大,在考察范圍內的超聲波能量不能進一步將分子進一步打斷,所以溶解度變化不大[18]。

2.2 超聲處理對麥胚分離蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性(H0)是評價蛋白質構象改變和相關功能性質的重要結構參數,超聲功率對麥胚分離蛋白H0(以熒光強度表征)的影響如圖2所示,H0開始隨著超聲功率的增大而增大,當超聲功率超過800 W時H0就不在增大,幾乎保持不變,在800 W時H0比未超聲提高了22.39%。這與溶解度的變化趨勢是一直的。說明超聲處理可以使麥胚分離蛋白分子展開,破壞蛋白質分子之間的疏水相互作用,使蛋白分子內部的疏水殘基和集團暴露在蛋白質分子表面,從而使H0提高。同樣當處理功率達到一定程度后,在考察范圍內的超聲波所具有的能量不能進一步將分子打斷[18],所以不能使H0進一步提高。

圖2 超聲功率對麥胚分離蛋白ANS熒光光譜的影響Fig.2 Effect of ultrasound power on the isolated DWPGANS fluorescence intensity

隨著超聲波功率的增加,麥胚分離蛋白表面疏水性開始增加,蛋白的溶解度也持續平穩增加, Yingqiu Li等在研究脈沖電場對大豆分離蛋白物理化學性質的影響時也出現了這種現象[10]。出現這種現象的原因可能歸因于以下兩個方面:①蛋白質中的自由氨基群能和鄰近羧基群發生靜電引力,使蛋白分子聚集,溶解度下降;超聲波處理能夠打斷自由氨基群和鄰近羧基群之間的聯系,阻止蛋白分子聚集,使蛋白溶解度得到提高[19]。②小麥胚芽蛋白中谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸含量較高,當小麥胚芽球蛋白經超聲波處理后,其分子發生了伸展,使較多的谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸充分暴露,這些氨基酸的暴露對蛋白溶解度的提高具有重要作用[20]。

2.3 超聲波處理對小麥胚芽分離蛋白熒光光譜的影響

圖3 超聲波功率對小麥胚芽球蛋白熒光光譜的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the fluorescence spectra of wheat germ globulin

分別對不同超聲波功率處理的小麥胚芽球蛋白進行熒光掃描,掃描條件為激發波長380 nm,發射波長300～700 nm。熒光光譜截圖如圖3所示。從圖3可以看出,在超聲波前處理麥胚芽分離蛋白的激發熒光強度在發射波長340 nm附近明顯高于對照組,且熒光峰移動了10 nm;而不同超聲處理下蛋白激發熒光強度和熒光峰位置差異不大。蛋白具有內源熒光,蛋白激發熒光強度的改變或者發射波長的改變都可以說明蛋白分子結構發生了改變[21]。

2.4 超聲處理對麥胚蛋白游離巰基含量的影響

圖4 不同超聲處理功率對麥胚分離蛋白SHF含量的影響Fig.4 Effect of ultrasound treatment power on the SHF content of the isolated DWPG

不同超聲功率對麥胚分離蛋白巰基含量SHF的影響如圖4所示,從圖4可以看出,在超聲波功率低于400 W時,隨著超聲波功率的增加,小麥胚芽球蛋白巰基含量迅速增加,在超聲波功率低于400 W時超聲處理的麥胚分離蛋白的游離巰基含量增加幅度較小。蛋白分子中巰基的減少意味著蛋白分子的折疊,相反則說明蛋白分子發生了伸展[10,22]。本研究中,巰基的變化說明小麥胚芽分離蛋白經超聲波處理后空間結構發生了變化,蛋白分子發生了伸展。

2.5 超聲處理對麥胚水解度的影響

不同超聲功率前處理對Alcalase酶解相應處理小麥胚芽分離蛋白樣品水解度的影響如圖5所示。從圖5中可以看出超聲處理并沒有對水解度產生影響,因此超聲處理沒有促使更多的肽鍵被水解。

2.6 超聲處理對酶解制備麥胚分離蛋白ACE抑制肽活性的影響

不同超聲功率下前處理對制備小麥胚芽分離蛋白酶解產物ACE抑制活性的影響如表2所示。由結果表明,超聲波前處理可以有效提高ACE的相對抑制活性,ACE相對抑制活性在800W處理后就幾乎不在增加。這與超聲處理對麥胚分離蛋白表面疏水性影響的變化規律是一致的。因此在測定條件下采用800W,前處理20min麥胚分離蛋白就可以有效提高酶解產物的ACE抑制活性,使相對抑制活性提高41.09%。

圖5 不同超聲功率對麥胚分離蛋白水解度的影響Fig.5 Effect of ultrasound power on the hydrolysis degree of the isolated DWPG

由于Alcalase酶解超聲處理麥胚分離蛋白時與未處理之間的水解度沒有變化,可以推斷出相對ACE抑制活性的提高不是由于水解產生了更多肽造成的。而超聲波處理對麥胚分離蛋白表面疏水集團的含量,溶解度和游離巰基含量的影響可以看出,當超聲波功率低于800 W時,隨著超聲波功率的增加,麥胚芽分離蛋白的結構變化迅速;超聲波功率大于800 W時,麥胚分離蛋白的結構變幅變緩。而相應超聲處理的麥胚分離蛋白酶解產物的相對ACE抑制率變化與結構變化趨勢基本相同。因此,超聲前處理麥胚分離蛋白的酶解產物ACE抑制活性提高是由于超聲處理使麥胚蛋白結構發生變化暴露了新的酶切位點。具體表現為麥胚蛋白表面疏水性著顯提高,疏水殘基和集團外露,而肽段C端為疏水性氨基酸是高活性ACE抑制肽的重要條件,Alcalase可作用的疏水性位點增多,促進了末端疏水性多肽的釋放,產生了相對較多的高活性的ACE抑制肽。

表2 超聲波功率對制備小麥胚芽分離蛋白ACE抑制肽活性的影響Tab.2 Effect of ultrasound power on the ACE inhibitory activity of DWGP hydrolysis protein

4 結 語

1)超聲波處理麥胚蛋白的物理化學性質分析表明:超聲波處理可以提高麥胚分離蛋白的表面疏水性和麥胚分離蛋白的溶解度,游離巰基含量以及超聲波處理后麥胚分離蛋白的熒光光譜發生變化,說明超聲處理前后麥胚分離蛋白處理前后結構發生了改變。

2)超聲波前處理麥胚分離蛋白可以提高制備的麥胚分離蛋白ACE抑制肽的抑制活性;在測定條件下采用800W,前處理20min麥胚分離蛋白就可以有效提高酶解產物的ACE相對抑制活性,達41.09%。這是由于超聲處理顯著提高了麥胚分離蛋白表面的疏水活性,疏水殘基和集團外露(C端疏水性氨基酸是高活性ACE抑制肽的重要條件), Alcalase能作用的疏水性位點增多,促進了末端疏水性氨基酸的釋放,產生了相對較多的高活性的ACE抑制肽導致的。

[1]Ondetti MA,Rubin B,Cushman DW.Design of specific inhibitors of angiotensin I-converting enzyme:new class of orally active antihypertensive agents[J].Science,1977,196:441-444.

[2]Chiang,Wen-Dee,Tsou,et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane reactor[J].Food Chemistry,2006,98(4):725-732.

[3]于婭,楊瑞金,王璋.牡蠣功能短肽的制備及ACE抑制活性.無錫輕工大學學報,2004,23(2):49-66.

YU Ya,YANG Rui-jin,WANG Zhang.Preparation of oyster functional oligopeptides and its ACE activity inhibiton capabitivty[J].Journal of Wuxi University of Light Industry,2004,23(2):49-66.(in Chinese)

[4]Bonomi F,Fiocchi A,Frokiaer H,et al.Reduction of immunoreactivity of bovine b-lactoglobulin upon combined physical and proteolytic treatment[J].Journal of Dairy Research,2003,70:51-59.

[5]Ana Quiro s,Rosa Chichon,Isidra Recio,et al.The use of high hydrostatic pressure to promote the proteolysis and re-lease of bioactive peptides from ovalbumin[J].Food Chemistry,2007,104:1734-1739.

[6]Blanca Hern andez-Ledesma,Mercedes Ramos,Isidra Recio,Lourdes Amigo.Effect ofβ-lactoglobulin hydrolysis with thermolysin under denaturing temperatures on the release of bioactive peptides[J].Journal of Chromatography A,2006,11 (16):31-37.

[7]楊瑛,李全祿,姬艷紅,等.超聲波處理在生物工程中的應用及展望[J],安徽農業科學,2008,4:1284-1285.

YANG Ying,LI Quan-lu,J I Yan-hong,et al.Application of ultrasonic technique in ergonomics-actuality and prospect[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences,2008,4:1284-1285.

[8]馬海樂,辛志宏,吳守一.采用堿提酸沉與淀粉酶解復合法制備小麥胚芽蛋白的試驗研究[J],農業工程學報,2004,20 (6):178-180.

MA Haile,XIN Zhihong,WU Shou-yi Preparation of wheat germ protein by combining alkali dissolution-acid deposition withα-amylase hydrolysis[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering,2004,20(60):178-180(in Chinese)

[9]陳俊輝,陶力,李俊,等.生物化學實驗[M],第二版,北京,科學出版社,2004:244-249.

[10]YINGqiu Li,ZHENGxing Chena,Haizhen Moc.Effects of pulsed electric fields on physicochemical properties of soybean protein isolates[J].LWT,2007,40:1167-1175.

[11]Kato A,Nakai S.Hydrophobicity determined by a fluorescence probe methods and its correlation with surface properties of proteins[J].Biochimicaet Biophysica Acta,1980,624:13-20.

[12]Beveridge T,Toma S J,Nakai S.Determination of SH and S–S groups in some food proteins using Ellman’s reagent [J].Journal of Food Science,1974,39:49-51.

[13]VanessaVermeirssen,Arie van der Bent,JohnVan Camp,et al.A quantitative in silico analysis calculates the angiotensin I converting enzyme(ACE)inhibitory activity in pea and whey protein digests[J].Biochimie,2004,86:231-239.

[14]Murray B A,Walsh D J,FitzGerald R J.Modification of the furanacryloyl-L-phenylalanylglycylglycine assay for determination of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity[J].Journal of Biochemical and Biophysical Methods,2004 (59):127-137.

[15]劉志國,王亞林.米糠蛋白降血壓肽(ACE抑制肽)的制備方法:中國200410012953.6[P].2005-01-12.

[16]Molina E,Papadopoulou A,Ledward D A.Emulsifying properties of high pressure treated soy protein isolate and7Sand11S globulins[J].Food Hydrocolloids,2001,15:263-269.

[17]Chin C L,Angela M,Tellez G M.Physical and mechanical properties of peanut protein films[J].Lebensm,2004,37:731 -738.

[18]劉國琴,李琳,李冰,等.超聲和超高壓處理對大豆分離蛋白特性影響的研究[J],河南工業大學學報:自然科學版, 2006,26(3):1-4.

Liu Guo-qin,Li Lin,Li Bing,et al.Study on the effect of power ultrasound and high pressure on solubility and forming properties of soybean protein isolate and mechanism[J].Journal of Zhengzhou Institute of Technology,2005,26(3):1-4. (in Chinese)

[19]Trevino S,Scholtz J M,Pace C N.Amino acid contribution to protein solubility:Asp,Glu,and Ser contribute more favorably than the other hydrophilic amino acids in rNase sa[J].J Mol Biol,2007,366:449-460.

[20]Cornec M.,Kim D A,NarsimhanG,et al.Adsorption dynamics and interfacial properties ofα-lactalbumin in native and molten globule state conformation at air-water interface[J].Food Hydrocolloids,2001,15:303-313.

[21]吳丹,徐桂英.光譜法研究蛋白質與表面活性劑的相互作用[J].物理化學學報,2006,22(2):254-260.

WU Dan,XU Gui-Ying.Study on protein-surfactant interaction by spectroscopic methods[J].Acta Physico-Chimica Sinica,2006,22(2):254-260(in Chinese)

[22]Arolas J L,Aviles F X,Chang J Y,et al.Folding of small disulfide-rich proteins:clarifying the puzzle[J].TRENDS in Biochemical Sciences,2006,31(5):292-301.

(責任編輯:楊萌)

Effect of Ultrasound Treatment on the Defatted Wheat Germ Protein Properties and its ACE Inhibition Activity

ZHAO Weirui1,MA Haile＊1,2,3, J IA Junqiang1, LI Yunliang1, Yang Huili1
(1.College of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang,212013,China;2.College of Food and Biological Engineering,University of Science and Technology,Luoyang 471039,China;3.Jiangsu Provincial Research Center of Bio-processing and Separation Engineering of Agri-products,Zhenjiang 212013,China)

The aim of this study is to enhance the anti-hypertension activity of defatted wheat germ protein(DWGP)hydrolysate,for this,ultrasound was employed.The effects of ultrasonic power on the different indexes have been carefully investigated and an obvious difference on free sulfhydryl and fluorescence spectra of DWGP after ultrasound treatment was observed but the DWPG hydrolysis degree did not affectby the ultrasound treatment.The solubility and hydrophobicity of wheat germ globulin increase with the increasing of ultrasonic power(less than 800w).Furthermore,the relative ACE inhibitory activity of the hydrolysate was increased by 41.09%when treated by 800w ultrasound,due to the structure change of DWPG.

ultrasound treatment,defatted wheat germ protein isolate,structure,ACE inhibitoryactivity,enzymolysis

文獻標識碼:A

1673-1689(2010)02-0177-06

2009-04-11

國家863計劃項目(2007AA10Z321);江蘇省普通高校研究生科研創新計劃資助(CX07B-183z)。

＊通信作者:馬海樂(1963-),男,陜西咸陽人,工學博士,教授,博士生導師,主要從事食品生物技術以及生物能源方面的研究。Email:mhl@ujs.edu.cn