牛凝乳酶全長cDNA的克隆及其原核表達載體的構建

張莉, 姜媛媛, 張健, 楊貞耐

(吉林省農業科學院農產品加工研究中心,吉林長春 130033)

牛凝乳酶全長cDNA的克隆及其原核表達載體的構建

張莉, 姜媛媛, 張健, 楊貞耐＊

(吉林省農業科學院農產品加工研究中心,吉林長春 130033)

從小牛皺胃中提取凝乳酶(Chymosin)總RNA,經過RT-PCR獲得凝乳酶cDNA,純化后與pMD-18T載體連接,轉化大腸桿菌JM109,通過雙酶切和序列測定,獲得了凝乳酶全長基因序列。序列測定表明,凝乳酶全長核苷酸長度為1 143 bp,編碼381個氨基酸。與GenBank上已發表序列NM_180994進行比較,核苷酸同源性為99.56%。將該基因片段克隆到原核表達載體pET-22b中,構建重組質粒pET-22b/Chymosin,所獲重組質粒經過酶切、測序鑒定,證實含有目的片段,且連接、構建正確,為凝乳酶的進一步表達奠定了基礎。

凝乳酶;克隆;原核表達載體;構建

凝乳酶(Chymosin)是從未斷奶的小牛皺胃中提取的一種天冬氨酸蛋白酶,其主要的生物學功能是水解牛乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106鍵,導致牛乳凝結,因此被廣泛用于干酪制造業。隨著世界范圍內干酪產量的巨增及全球性小牛短缺,使得天然凝乳酶供應不足,應用基因工程技術可以使凝乳酶基因在微生物中高效表達,從而為實現工業化生產打下良好的基礎。

牛凝乳酶通常在小牛第四胃,即皺胃中合成為一個含有381個氨基酸的前體聚肽——凝乳酶原前體(Preprochymosin),凝乳酶原前體在分泌過程中去掉16個信號肽形成含有365個氨基酸的凝乳酶原(Prochymosin)。凝乳酶原沒有活性,它在酸性p H下通過多步的自動催化過程,去掉N末端42個氨基酸形成有活性的含有323個氨基酸的蛋白質——凝乳酶成熟肽(Chymosin)。在一定條件下,凝乳酶原可以通過去除N末端27個氨基酸形成另一種酶,假凝乳酶(Pesudochymosin)。凝乳酶和假凝乳酶都具有凝乳活性。凝乳酶蛋白結構見圖1。

圖1 牛凝乳酶蛋白質結構Fig.1 Protein structure of bovine chymosin

牛凝乳酶的基因組DNA是由8個內含子分開的9個外顯子組成[2]。牛凝乳酶有3個主要的形態:A,B和C,凝乳酶B的含量最高[3]。凝乳酶A和B只有1個氨基酸位置不同:凝乳酶A在243位(胃蛋白酶編碼)上是Asp,而凝乳酶B在這個位置是Gly。凝乳酶C是凝乳酶A降解后,去掉3個殘基Asp244-Phe246后的產物[4]。

作者根據GenBank上發表的凝乳酶B基因(NM_180994)設計引物,從小牛皺胃中提取凝乳酶總RNA,經過RT-PCR獲得牛凝乳酶全長cDNA,構建原核表達載體,為凝乳酶的工業化制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

皺胃粘膜取自未斷奶的荷斯坦小牛第四胃,大腸桿菌JM109,表達載體pET-22b;作者所在實驗室保存。

限制性內切酶,DNA回收試劑盒,T4 DNA連接酶:購于MBI,Trizol Reagent;RT-PCR試劑盒:購于Invitrogen;pMD-18T,DL2000,DL15000,Ex-Taq,dNTP:購于Ta KaRa公司。

1.2 儀器與設備

PCR擴增儀:Eppendorf公司制造;高速冷凍離心機:Thermo公司制造;超低溫冰箱:Thermo公司制造;電泳儀:Bio-rad公司制造;凝膠成像系統:Alpha公司制造;紫外可見分光光度計:Varian公司制造。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設計與合成 應用Primer(Version 5.0)基因分析軟件,參照GenBank發表的凝乳酶(NM_180994)基因序列設計一對引物,并且在上游引物中加入Nco I酶切位點,下游引物中加入Xho I酶切位點。該對引物理論跨幅包括凝乳酶CDS序列1 143 bp,引物由上海生工公司合成。

1.3.2 凝乳酶總RNA的提取 無菌采取小牛皺胃,液氮保存。凝乳酶總RNA的提取按照Invitrogen Trizol的說明書,-70℃保存。取5μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.3.3 RT-PCR體外擴增目的基因片段

1)合成cDNA:取1μL提取的總RNA于滅菌的0.5 mL離心管中,置于冰上,再加入DEPC水8μL,1μL 50μmol/L Oligo(dT)20,于65℃水浴保溫5 min后立即置于冰上,加入5×cDNA Synthesis Buffer 4μL,0.1 mol/L DTT 1μL,1μL 40 U/μL RNase OU TTM,DEPC水1μL,15 U/μL Thermoscript RT 1μL,混勻后于50℃反應60 min,之后于85℃反應5 min終止反應。加1μL RNase H,37℃、20 min去除RNA模板。取2μL進行PCR反應,剩余物于-20℃貯存。

2)PCR反應:反應體系為10×PCR Buffer Minus Mg 5μL,50 mmol/L MgCl21.5μL,10 mmol/L dNTP Mix 1μL,20μmol/L sense primer 0.5μL,20μmol/L antisense primer 0.5μL,5 U/μL Platium tag DNA polymerase 0.4μL,cDNA 2μL,DEPC-treated Water 39.1μL。

反應條件為:94℃預變性5 min,然后94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸90 s,72℃延伸10 min,30次循環。產物用0.8 g/dL瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3.4 PCR產物TA克隆 將電泳回收產物與pMD18-T載體進行連接反應,16℃連接1 h后,將連接產物轉化JM109感受態細胞,在含有X-gal、IPTG和Amp的LB瓊脂平板培養基上培養12 h,挑取白斑菌落接種于含有Amp的LB液體培養基中,37℃振蕩培養12～16 h。提取質粒,進行酶切鑒定。選擇酶切鑒定正確的質粒送上海生工公司進行序列測定。

1.3.5 表達載體的構建 將含有目的基因的質粒和pET-22b同時用Nco I和Xho I酶切,分別回收后用T4 DNA連接酶連接,構建重組表達質粒pET-22b/Chymosin。再將連接產物轉化JM109感受態細胞,在含有Amp的LB瓊脂平板培養基上培養16 h,挑取陽性菌落,接種于含有Amp的LB液體培養基中,37℃振蕩培養12～16 h。按質粒提取試劑盒說明提取重組質粒,再進行PCR及酶切電泳檢測鑒定。選擇酶切和PCR鑒定為重組陽性的質粒,送上海生工公司進行序列測定,驗證重組質粒讀碼框的正確性。

2 結 果

2.1 凝乳酶總RNA鑒定

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA,28S、18S和5S條帶明亮、清晰,因此,提取的RNA可用于后續試驗,見圖2。

圖2 Chymosin總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of total RNA of Chymosin

2.2 RT-PCR擴增產物鑒定

以提取的總RNA為模板,使用反轉錄試劑盒進行RT-PCR反應,瓊脂糖電泳檢測擴增結果見圖3,擴增的DNA片段與預期大小一致,約為1 200 kb。

2.3 PCR擴增產物的連接和篩選

用DNA回收試劑盒對凝乳酶cDNA RT-PCR擴增產物進行純化回收,然后與pMD-18T進行TA連接,轉化大腸桿菌JM109感受態細胞。藍白篩選挑取白色菌落擴培后,進行堿變性法提取質粒,用Nco I和Xho I雙酶切及PCR鑒定,選出陽性克隆,命名為JM109/18T/Chymosin。

2.4 克隆質粒測序

將上述陽性克隆質粒送上海生工,進行正反兩個防線的序列測定,報告的核苷酸序列為1 257 bp,除去兩端引物中的多余堿基,得到全長為1 143 bp的核苷酸序列,含有一個完整的閱讀框,編碼381個氨基酸,見圖4。此序列已經提交到GenBank,收錄號為FJ768675。與GenBank數據庫中凝乳酶基因NM_180994序列進行比對分析,核苷酸同源性為99.56%。結果顯示有5個堿基變異,第44 bp (以ATG為1計)由A→G,第431 bp由A→G,第687 bp由A→G,第816 bp由T→C,第1 007 bp由A→G,其編碼的氨基酸序列中有1個不一致,第229位氨基酸由N(Asn)→D(Asp)(見粗體下劃線)。

2.5 重組質粒的構建

將18T/Chymosin及表達載體pET-22b經Nco I和Xho I雙酶切后,純化回收后構建重組質粒,轉化JM109后挑選白色菌落,提取質粒后酶切及PCR擴增,經瓊脂糖電泳鑒定在約1 200 bp處有特異條帶,經Nco I和Xho I雙酶切后電泳出現兩條帶,其中一條為載體質粒,約5 500 bp,另一條帶為所克隆的Chymosin基因片段,約1 200 bp,見圖5。測序結果表明,該轉化菌的質粒中確實含有目的基因片段,且讀碼框正確,重組質粒pET-22b/ Chymosin構建成功。

圖4 重組凝乳酶的核苷酸序列及其編碼的氨基酸Fig.4 The nucleotide sequence and deduced amino acids of recombinant chymosin

圖5 重組表達質粒PCR和酶切鑒定圖Fig.5 Identification of recombinant plasmid by digested (Nco I+Xho I)and PCR

3 結 語

作者所研究的凝乳酶B基因,經過比對,發現克隆的凝乳酶基因與GenBank上NM_180994核苷酸序列有5個堿基變異,但其中有4個變異的堿基并不影響編碼的氨基酸,所以氨基酸序列只有229位的Asn(N)突變為Asp(D)。

通過比對分析發現,本研究得到的凝乳酶氨基酸序列與目的序列NM_180994相差一個氨基酸(箭頭指示處),但是與Protein Data Bank上登錄的凝乳酶蛋白質結構4CMS的氨基酸序列完全一致[5],見圖6。通過進一步分析GenBank上登錄的凝乳酶A和C的氨基酸序列[6-7],根據Danley等人(1988)對凝乳酶的描述,凝乳酶A,B和C在此位點的氨基酸序列應該是一致的。進而與另外兩種反芻動物,綿羊[8]及駱駝[9]的凝乳酶氨基酸序列進行比對,發現其第229位上的氨基酸序列與本研究所得到的氨基酸序列一致,所以不能確定此位點是否為突變,有可能是GenBank上登錄的NM_ 180994序列有誤。通過以上分析可以判斷,不論此位點是否為突變,對凝乳酶的功能沒有影響,克隆的凝乳酶基因可用于下一步的實驗。

圖6 氨基酸序列比對結果Fig.6 Alignment of the peptide sequences

凝乳酶作為乳凝固用酶廣泛應用于干酪的工業化生產。我國干酪生產所用凝乳酶主要依賴于進口,利用生物工程技術生產凝乳酶,可以減少對進口產品的依賴,降低干酪生產成本,促進我國干酪產業的發展。

pET系統是在E.coli中克隆表達重組蛋白的首選,pET系列載體是利用大腸桿菌T7噬菌體轉錄系統進行表達的載體。將凝乳酶基因片段克隆到原核表達載體pET-22b中,構建重組質粒pET-22b/Chymosin,所獲重組質粒經過酶切、測序鑒定,證實含有目的基因片段,且連接、構建正確,為凝乳酶的工業化生產奠定了基礎。

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(責任編輯:李春麗)

Cloning and Prokaryotic Expression Vector Construction of Bovine Chymosin

ZHANG Li, J IANG Yuan-yuan, ZHANGJian, YANG Zhen-nai＊
(Center of Agro-Food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun,130033,China)

In this study,the total RNA of chymosin was extracted from absomum of calf and its cDNA was obtained by RT-PCR.The purified RT-PCR products and pMD-18T vector were ligated and transformed into host strainE.coliJM109.The full length of Chymosin gene is consist of 1 143 bp,and encodes 381 amino acids.The homology of the nucleotides with NM_ 180994 is 99.56%.The aim gene was expression on the prokaryotic expression vector pET-22b and a recombinant plasmid pET-22b/Chymosin was constructed successfully.

chymosin,cloning,prokaryotic expression vector,construction

Q 785

:A

1673-1689(2010)02-0271-05

2009-02-27

國家863計劃項目(2006AA10Z306);吉林省科技廳重點項目(20060219、20080228);現代農業產業體系專項資金項目。

＊通信作者:楊貞耐(1965-),男,江西廣豐人,博士,研究員,主要從事乳品工藝及生物技術方面的研究。Email: zyang@cjaas.com